प्राथमिक संस्कृति में विभेदित माउस एडिपोसाइट्स: इंसुलिन प्रतिरोध का एक मॉडल
Summary
यह प्रोटोकॉल चमड़े के नीचे की वसा से माउस प्रीडिपोसाइट्स के अलगाव, परिपक्व एडिपोसाइट्स में उनके भेदभाव और इंसुलिन प्रतिरोध के प्रेरण का वर्णन करता है। पश्चिमी धब्बा के माध्यम से इंसुलिन सिग्नलिंग मार्ग के सदस्यों के फॉस्फोराइलेशन / सक्रियण द्वारा इंसुलिन कार्रवाई का मूल्यांकन किया जाता है। यह विधि प्राथमिक एडिपोसाइट्स में इंसुलिन प्रतिरोध / संवेदनशीलता के प्रत्यक्ष निर्धारण की अनुमति देती है।
Abstract
इंसुलिन प्रतिरोध अपने लक्ष्य कोशिकाओं पर इंसुलिन का कम प्रभाव है, जो आमतौर पर इंसुलिन रिसेप्टर सिग्नलिंग में कमी से प्राप्त होता है। इंसुलिन प्रतिरोध टाइप 2 मधुमेह (टी 2 डी) और दुनिया भर में उच्च प्रसार के अन्य मोटापे से व्युत्पन्न रोगों के विकास में योगदान देता है। इसलिए, इंसुलिन प्रतिरोध के अंतर्निहित तंत्र को समझना बहुत प्रासंगिक है। विवो और इन विट्रो दोनों में इंसुलिन प्रतिरोध का अध्ययन करने के लिए कई मॉडलों का उपयोग किया गया है; प्राथमिक एडिपोसाइट्स इंसुलिन प्रतिरोध के तंत्र का अध्ययन करने और अणुओं की पहचान करने के लिए एक आकर्षक विकल्प का प्रतिनिधित्व करते हैं जो इस स्थिति और इंसुलिन-संवेदीकरण दवाओं के आणविक लक्ष्यों का मुकाबला करते हैं। यहां, हमने ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-α (टीएनएफ-α) के साथ इलाज किए गए संस्कृति में प्राथमिक एडिपोसाइट्स का उपयोग करके एक इंसुलिन प्रतिरोध मॉडल स्थापित किया है।
चुंबकीय कोशिका पृथक्करण तकनीक द्वारा कोलेजनेज-पचने वाले माउस चमड़े के नीचे वसा ऊतक से अलग एडिपोसाइट्स अग्रदूत कोशिकाओं (एपीआई) को प्राथमिक एडिपोसाइट्स में विभेदित किया जाता है। इंसुलिन प्रतिरोध को तब टीएनएफ-α के साथ उपचार द्वारा प्रेरित किया जाता है, एक प्रोइंफ्लेमेटरी साइटोकिन जो इंसुलिन सिग्नलिंग कैस्केड के सदस्यों के टायरोसिन फॉस्फोराइलेशन / सक्रियण को कम करता है। इंसुलिन रिसेप्टर (आईआर), इंसुलिन रिसेप्टर सब्सट्रेट (आईआरएस -1), और प्रोटीन काइनेज बी (एकेटी) के फॉस्फोराइलेशन में कमी को पश्चिमी धब्बा द्वारा निर्धारित किया जाता है। यह विधि वसा ऊतक में इंसुलिन प्रतिरोध की मध्यस्थता करने वाले तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण प्रदान करती है।
Introduction
इंसुलिन अग्नाशयी आइलेट β-कोशिकाओं और ग्लूकोज और लिपिड चयापचय के प्रमुख नियामक द्वारा निर्मित एक उपचय हार्मोन है। इसके कई कार्यों में, इंसुलिन ग्लूकोज अपटेक, ग्लाइकोजन संश्लेषण, ग्लूकोनोजेनेसिस, प्रोटीन संश्लेषण, लिपोजेनेसिस और लिपोलिसिस1 को नियंत्रित करता है। अपने रिसेप्टर (आईआर) के साथ इंसुलिन इंटरैक्शन के बाद प्रारंभिक आणविक संकेत आईआर2 की आंतरिक टायरोसिन प्रोटीन काइनेज गतिविधि का सक्रियण है, जिसके परिणामस्वरूप इसके ऑटोफॉस्फोराइलेशन3 और बाद में इंसुलिन रिसेप्टर सब्सट्रेट्स (आईआरएस) नामक प्रोटीन के एक परिवार की सक्रियता होती है, जो एडाप्टर प्रोटीन को बांधता है जिससे प्रोटीन किनेसेस4 का एक कैस्केड सक्रिय होता है। . इंसुलिन दो मुख्य सिग्नलिंग मार्गों को सक्रिय करता है: फॉस्फेटिडिलिनोसिटोल 3-काइनेज (पीआई 3 के)-प्रोटीन काइनेज बी (एकेटी) और रास-माइटोजन-सक्रिय प्रोटीन काइनेज (एमएके)। पूर्व ईंधन होमियोस्टैसिस के विनियमन सहित विभिन्न शारीरिक कार्यों में शामिल कई डाउनस्ट्रीम प्रभावकों के सक्रियण के लिए एक प्रमुख शाखा बिंदु या नोड 4,5 का गठन करता है, जबकि बाद वाला सेल विकास और भेदभाव 4,6 को नियंत्रित करता है। इंसुलिन क्रियाएं अंततः सेल प्रकार और शारीरिक संदर्भपर निर्भर करती हैं।
मुख्य इंसुलिन-उत्तरदायी चयापचय ऊतकों में से एक वसा ऊतक है। सफेद वसा ऊतक मनुष्यों और कृन्तकों में वसा का सबसे प्रचुर प्रकार है, जो चमड़े के नीचे वसा (त्वचा और मांसपेशियों के बीच) और आंत की वसा (पेट की गुहा में अंगों के आसपास) के भीतर वितरित होता है। उनकी बड़ी मात्रा को देखते हुए, एडिपोसाइट्स या वसा कोशिकाएं वसा ऊतक में सबसे प्रचुर मात्रा में कोशिका प्रकार हैं। ये वसा कोशिकाएं भूरे / बेज (थर्मोजेनिक), गुलाबी (स्तन ग्रंथि में), और सफेद 8,9 हो सकती हैं। सफेद एडिपोसाइट्स शरीर में मुख्य ऊर्जा भंडार को ट्राइग्लिसराइड्स, एक इंसुलिन-निर्भर प्रक्रिया के रूप में रखते हैं। इंसुलिन ग्लूकोज परिवहन और लिपोजेनेसिस को बढ़ावा देता है, जबकि यह लिपोलिसिस या लिपिड ब्रेकडाउन 7,10 को रोकता है। यह प्रीडिपोसाइट्स को एडिपोसाइट्स में विभेदित करने की सुविधा भी प्रदान करता है – परिपक्व वसा-भंडारण कोशिकाएं11।
इंसुलिन प्रतिरोध तब होता है जब एक सामान्य इंसुलिन स्तर एक क्षीण जैविक प्रतिक्रिया पैदा करता है, जिसके परिणामस्वरूप प्रतिपूरक हाइपरइन्सुलिनमिया12 होता है। इंसुलिन प्रतिरोध अधिक वजन और मोटापे5 से जुड़ी एक स्थिति है, जिसे संयुक्त करने पर टाइप 2 मधुमेह (टी 2 डी) और अन्य चयापचय रोगहोते हैं। हाइपरइन्सुलिनमिया सामान्य रक्त शर्करा के स्तर को बनाए रखने के लिए परिधीय ऊतकों में इंसुलिन प्रतिरोध की भरपाई करताहै। हालांकि, अंतिम β-सेल हानि या थकावट, इंसुलिन प्रतिरोध को बढ़ाने के साथ, टी 2 डी 5 के अनुरूप उच्च रक्त शर्करा के स्तर की ओर जाताहै। इसलिए, इंसुलिन प्रतिरोध और हाइपरइन्सुलिनमिया मोटापे से व्युत्पन्न चयापचय रोगों के विकास में योगदान करसकते हैं। इसके अलावा, मोटापा पुरानी निम्न श्रेणी की स्थानीय सूजन का कारण बन सकता है जो वसा ऊतक 15,16,17 में इंसुलिन प्रतिरोध को बढ़ावा देता है। इसके अलावा, वसा ऊतक में मोटापा-व्युत्पन्न परिवर्तन, जैसे फाइब्रोसिस, सूजन, और कम एंजियोजेनेसिस और एडिपोजेनेसिस, कम एडिपोनेक्टिन सीरम स्तर (एक इंसुलिन संवेदीकारक) और प्लास्मिनोजेन एक्टिवेटर इनहिबिटर 1 (पीएआई -1), मुक्त फैटी एसिड और रक्तप्रवाह में एक्सोसोम जैसे कारकों के स्राव में वृद्धि करते हैं, जिससे इंसुलिन प्रतिरोध17 बढ़ जाता है।
इंसुलिन प्रतिरोध के अंतर्निहित कई पहलू अज्ञात रहते हैं। इन विट्रो और विवो मॉडल को वसा ऊतक सहित प्रमुख लक्ष्य ऊतकों में इंसुलिन प्रतिरोध की मध्यस्थता करने वाले तंत्र का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है। इन विट्रो मॉडल का लाभ यह है कि शोधकर्ताओं के पास पर्यावरणीय स्थितियों का अधिक नियंत्रण है और विशिष्ट सेल प्रकारों में इंसुलिन प्रतिरोध का मूल्यांकन कर सकते हैं। विशेष रूप से, एडिपोसाइट्स अग्रदूत कोशिकाओं (एपीसी) में दाता ऊतक का व्यक्तिगत फेनोटाइप होता है, जो एडिपोसाइट्स सेल लाइनों की तुलना में शरीर विज्ञान को बेहतर ढंग से प्रतिबिंबित कर सकता है। विट्रो में इंसुलिन प्रतिरोध को प्रेरित करने वाला एक मुख्य कारक ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-α (टीएनएफ-α) है। टीएनएफ-α एक प्रोइंफ्लेमेटरी साइटोकिन है जो वसा ऊतक18 में एडिपोसाइट्स और मैक्रोफेज द्वारा स्रावित होता है। जबकि यह उचित वसा ऊतक रीमॉडेलिंग और विस्तार19 के लिए आवश्यक है, टीएनएफ-α के लिए दीर्घकालिक जोखिम विवो में वसा ऊतक में और विट्रो20 में एडिपोसाइट्स में इंसुलिन प्रतिरोध को प्रेरित करता है। कई सेल प्रकारों के क्रोनिक टीएनएफ-α उपचार से आईआर और आईआरएस -1 दोनों के सेरीन फॉस्फोराइलेशन में वृद्धि होती है, जिससे टायरोसिन फॉस्फोराइलेशन में कमी आतीहै। सेरीन अवशेषों पर आईआरएस -1 का बढ़ा हुआ फॉस्फोराइलेशन आईआर टायरोसिन किनेज गतिविधि को रोकता है और उन प्रमुख तंत्रों में से एक हो सकता है जिसके द्वारा क्रोनिक टीएनएफ -α उपचार इंसुलिन कार्रवाई22,23 को बाधित करता है। टीएनएफ-α परमाणु कारक 2 बी किनेज β (आईकेके) और सी-जून एन टर्मिनल किनेज (जेएनके) 24 के सेरीन /थ्रेओनिन किनेज अवरोधक से जुड़े मार्गों को सक्रिय करता है। जेएनके एक जटिल प्रोइन्फ्लेमेटरी ट्रांसक्रिप्शनल प्रोग्राम को प्रेरित करता है लेकिन सीधे आईआरएस -16 को फॉस्फोराइलेट भी करता है।
इंसुलिन प्रतिरोध के रोगजनन को समझना टी 2 डी के खिलाफ भविष्य के उपचारों के विकास का मार्गदर्शन करने के लिए तेजी से महत्वपूर्ण हो गया है। एपीसी वसा कोशिका जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल साबित हुए हैं, जिसमें इंसुलिन के प्रति संवेदनशीलता और प्रतिरोध शामिल है, और प्रणालीगत वातावरण से स्वतंत्र एडिपोसाइट्स के आंतरिक गुणों की पहचान करने के लिए। एपीआई को आसानी से विभिन्न वसा डिपो से प्राप्त किया जा सकता है, और उपयुक्त परिस्थितियों में, परिपक्व एडिपोसाइट्स में विभेदित किया जा सकता है। इस विधि के साथ, एडिपोसाइट्स में इंसुलिन प्रतिरोध / संवेदनशीलता पर प्रत्यक्ष प्रभाव का मूल्यांकन किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह पेपर इंसुलिन प्रतिरोध का अध्ययन करने के लिए एक विधि प्रदान करता है जो टीएनएफ -α के साथ इलाज की गई संस्कृति में प्राथमिक एडिपोसाइट्स का उपयोग करता है। इस मॉडल का लाभ यह है कि प्राथमिक एडिपोसाइट्स को से…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम डैनियल मोंद्रागोन, एंटोनियो प्राडो, फर्नांडो लोपेज़-बैरेरा, मार्टिन गार्सिया-सर्विन, एलेजांद्रा कैस्टिला और मारिया एंटोनीटा कार्बाजो को उनकी तकनीकी सहायता के लिए धन्यवाद देते हैं, और पांडुलिपि को गंभीर रूप से संपादित करने के लिए जेसिका गोंजालेज नॉरिस। इस प्रोटोकॉल को कंसेजो नेशनल डी सिएन्सिया और टेक्नोलोजिया डी मेक्सिको (CONACYT), Fondo Sectorial de Investigacion para la Educacion Grant 284771 (Y.M.) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 1. Isolation mouse adipocyte precursor cells | |||
| ACK lysing buffer | LONZA | 10-548E | |
| Anti-Biotin Microbeads | Miltenyi | 130-090-485 | |
| Anti-CD31 | eBioscience | 13-0311-85 | |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi | ||
| Basement membrane matrix (matrigel) | Corning | 354234 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | Growth factor |
| BSA | Equitech-Bio, Inc. | BAC63-1000 | |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) – Biotin | eBioscience | 13-0451-85 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington Biochem | LS004197 | |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | |
| DMEM | GIBCO | 12800017 | |
| DMEM low glucose | GIBCO | 31600-034 | |
| EGF | Peprotech | 315-09 | Growth factor |
| FBS | GIBCO | 26140-079 | |
| ITS mix | Sigma | I3146 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
| LIF | Millipore | ESG1107 | Growth factor |
| Linoleic acid-albumin | Sigma | L9530 | |
| MCDB 201 medium | Sigma | M6770 | |
| Normocin | InvivoGen | ant-nr-2 | |
| PDGF-BB | Peprotech | 315-18 | Growth factor |
| Peniciline-Streptomycine | BioWest | L0022-100 | |
| Pre-Separation Filters (70 µm) | Miltenyi | 130-095-823 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16 / CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO | 25300062 | |
| 2. Adipocyte differentiation and insulin resistance induction | |||
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine [IBMX] | Sigma | I5879 | Differentiation cocktail |
| BMP4 | R&D Systems | 5020-BP-010 | Differentiation cocktail |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | Differentiation cocktail |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Rosiglitazone | Cayman | 71742 | Differentiation cocktail |
| TNFα | R&D Systems | 210-TA-005 | |
| 3. Evaluation of insulin signaling pathway by western blot | |||
| Anti-beta tubulin antibody | Abcam | ab6046 | |
| Bromophenol blue | BioRad | 161-0404 | Laemmli buffer |
| EDTA | Sigma | E5134 | RIPA buffer |
| EGTA | Sigma | E4378 | RIPA buffer |
| FluorChem E system | ProteinSimple | ||
| Glycerol | Sigma | G6279 | Laemmli buffer |
| Glycine | Sigma | G7126 | Running and Transfer buffer |
| Igepal | Sigma | I3021 | RIPA buffer |
| 2- mercaptoethanol | Sigma | M3148 | Laemmli buffer |
| Methanol | JT Baker | 907007 | Transfer buffer |
| NaCl | JT Baker | 3624-05 | TBS-T |
| NaF | Sigma | 77F-0379 | RIPA buffer |
| NaOH | JT Baker | 3722-19 | |
| Na4P2O7 | Sigma | 114F-0762 | RIPA buffer |
| Na3VO4 | Sigma | S6508 | RIPA buffer |
| Nitrocellulose membrane | BioRad | 1620112 | |
| Nonfat dry milk | BioRad | 1706404 | Blocking solution |
| Prestained protein standard | BioRad | 1610395 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340-5ML | |
| Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-035-132 | |
| Phospho- Insulin Receptor β | Cell signaling | 3024 | |
| Phospho-Akt (Ser473) Antibody | Cell signaling | 9271 | |
| Phospho-IRS1 (Tyr608) antibody | Millipore | 9432 | |
| Saccharose | JT Baker | 407205 | RIPA buffer |
| SDS | BioRad | 1610302 | Running and laemmli buffer |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34577 | |
| Tris-base | Promega | H5135 | Running, transfer and laemmli buffer |
| Tris-HCl | JT Baker | 4103-02 | RIPA buffer – TBS |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | TBS-T |
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