Трехмерное окрашивание цельной почки с помощью CUBIC
Summary
Настоящий протокол описывает метод очистки тканей и полноразмерное иммунофлуоресцентное окрашивание для трехмерной (3D) визуализации почек. Этот метод может предложить макроскопические перспективы в патологии почек, что приводит к новым биологическим открытиям.
Abstract
Хотя обычная патология предоставляла многочисленные сведения о микроструктуре почек, было трудно узнать точную структуру кровеносных сосудов, проксимальных канальцев, собирающих протоков, клубочков и симпатических нервов в почках из-за отсутствия трехмерной (3D) информации. Оптическая очистка является хорошей стратегией для преодоления этого большого препятствия. Несколько клеток в целом органе могут быть проанализированы с одноклеточным разрешением, сочетая очистку тканей и технику 3D-визуализации. Тем не менее, методы маркировки клеток для визуализации всего органа остаются недостаточно развитыми. В частности, окрашивание целых органов является сложной задачей из-за сложности проникновения антител. Настоящий протокол разработал окрашивание почек мыши для 3D-визуализации с помощью метода очистки тканей CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational Analysis). Протокол позволил визуализировать почечную симпатическую денервацию после ишемии-реперфузионного повреждения и гломеруломегалию на ранней стадии диабетической болезни почек с комплексной точки зрения. Таким образом, этот метод может привести к новым открытиям в исследованиях почек, обеспечивая макроскопическую перспективу.
Introduction
Почка состоит из различных клеточных популяций. Хотя обычная патология дает нам много информации о микроокружении почек, трехмерная (3D) визуализация необходима для точного понимания межклеточных перекрестных помех во время прогрессирования заболевания почек. В прошлом для 3D-визуализации всего органа1 требовалось выполнить огромное количество серийных секций и реконструкций изображений. Однако этот метод требовал слишком больших усилий и имел проблемы с точки зрения воспроизводимости.
Оптический клиринг является хорошей стратегией для преодоления этого препятствия 2,3. Помутнение тканей в основном связано с рассеянием и поглощением света, потому что каждый орган состоит из различных веществ, включая воду, белок и липиды. Таким образом, основной стратегией очистки тканей является замена воды и липидов в тканях реагентами, соответствующими показателю преломления (RI), которые обладают теми же оптическими свойствами, что и белки4. Для того чтобы наблюдать прозрачный образец, полезна световая листовая флуоресцентная микроскопия5. Световые листы освещают прозрачный образец сбоку, а сигналы возбуждения принимаются через объектив, расположенный в вертикальном положении6. Эта микроскопия получает информацию о поперечном сечении за один развертку, которая отличается от конфокальной или многофотонной флуоресцентной микроскопии. Таким образом, он может быстро получать z-стековые изображения с низким уровнем фотоотбеливания.
Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational Analysis (CUBIC) является одним из методов очистки тканей, который позволяет визуализировать весь орган с помощью флуоресцентной микроскопиисветового листа 2,7,8. CUBIC и цельное иммунофлуоресцентное окрашивание оптимизированы в настоящем исследовании для визуализации 3D-структур почек мыши 9,10,11. С помощью этого цельно-монтажного метода окрашивания визуализируется изменение почечных симпатических нервов после ишемии-реперфузионного повреждения 9,10 и клубомерулегалии на ранней стадии диабетической болезни почек11, а также кровеносных сосудов, проксимальных канальцев и собирающих протоков во всей почке9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Настоящий протокол позволял проводить 3D-визуализацию всей почки различных структур, таких как симпатические нервы, собирающие протоки, артерии, проксимальные канальцы и клубочки 9,10,11. Этот метод окрашивания предложил макроскопическо…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Часть этой работы была проведена в сотрудничестве с профессором Хироки Р. Уэда (Токийский университет), профессором Эцуо А. Сусаки (Университет Дзюнтендо), профессором Тецухиро Танака (Университет Тохоку), профессором Масафуми Фукагава, доктором Такехико Вада и доктором Хиротакой Комаба (Университет Токай).
Materials
| 14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube | Falcon | 352059 | Tissue clearing, staining, wash |
| 2,3-dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone/antipyrine | Tokyo Chemical Industry | D1876 | CUBIC-R+ |
| 37%-Formaldehyde Solution | Nacalai Tesque | 16223-55 | Post fixation |
| 4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Nacalai Tesque | 09154-85 | Kidney fixation |
| Alexa Flour 555-conjugated donkey anti-sheep IgG antibody | Invitrogen | A-21436 | Secondary antibody (1:100) |
| Alexa Flour 647-conjugated donkey anti-rabbit IgG antibody | Invitrogen | A-31573 | Secondary antibody (1:200) |
| Anti-aquaporin 2 (AQP2) antibody | Abcam | ab199975 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-podocin antibody | Sigma-Aldrich | P0372 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-sodium glucose cotransporter 2 (SGLT2) antibody | Abcam | ab85626 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-tyrosine hydroxylase (TH) antibody | Abcam | ab113 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-α-smooth muscle actin (α-SMA) antibody | Abcam | ab5694 | Primary antibody (1:200) |
| Blocker Casein in PBS | Thermo Fisher Scientific | 37528 | Staining buffer |
| Butorphanol Tartrate | Meiji | 005526 | Anesthetic |
| C57BL/6NJcl | Nippon Bio-Supp.Center | N/A | Mouse strain |
| Imaris | Bitplane | N/A | Imaging analysis software |
| Macro-zoom microscope | OLYMPUS | MVX10 | The observation unit of the custom-built microscope |
| Medetomidine Hydrochloride | Kyoritsu-Seiyaku | 008656 | Anesthetic |
| Midazolam | SANDOZ | 27803229 | Anesthetic |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Immersion oil |
| N-buthyldiethanolamine | Tokyo Chemical Industry | B0725 | CUBIC-L, CUBIC-R+ |
| Nicotinamide | Tokyo Chemical Industry | N0078 | CUBIC-R+ |
| Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether/Triton X-100 | Nacalai Tesque | 12967-45 | CUBIC-L, PBST |
| Silicon oil HIVAC-F4 | Shin-Etsu Chemical | 50449832 | Immersion oil |
| Sodium azide | Wako | 195-11092 | Staining buffer |
Riferimenti
- Velez-Fort, M., et al. The stimulus selectivity and connectivity of layer six principal cells reveals cortical microcircuits underlying visual processing. Neuron. 83 (6), 1431-1443 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Tainaka, K., et al. Chemical Landscape for Tissue Clearing Based on Hydrophilic Reagents. Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
- Keller, P. J., Dodt, H. U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
- Hasegawa, S., et al. Comprehensive three-dimensional analysis (CUBIC-kidney) visualizes abnormal renal sympathetic nerves after ischemia/reperfusion injury. Kidney International. 96 (1), 129-138 (2019).
- Hasegawa, S., Inoue, T., Inagi, R. Neuroimmune interactions and kidney disease. Kidney Research and Clinical Practice. 38 (3), 282-294 (2019).
- Hasegawa, S., et al. The oral hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibitor enarodustat counteracts alterations in renal energy metabolism in the early stages of diabetic kidney disease. Kidney International. 97 (5), 934-950 (2020).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Hasegawa, S., et al. Activation of sympathetic signaling in macrophages blocks systemic inflammation and protects against renal ischemia-reperfusion injury. Journal of the American Society of Nephrology. 32 (7), 1599-1615 (2021).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Klingberg, A., et al. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
- Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812 (2020).
- Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11 (1), 1-22 (2020).
