Tredimensionel farvning med hele nyrer med CUBIC
Summary
Den nuværende protokol beskriver en vævsrensningsmetode og helmonteret immunfluorescerende farvning til tredimensionel (3D) nyrebilleddannelse. Denne teknik kan tilbyde makroskopiske perspektiver i nyrepatologi, hvilket fører til nye biologiske opdagelser.
Abstract
Selvom konventionel patologi gav mange oplysninger om nyremikrostruktur, var det svært at kende den præcise struktur af blodkar, proksimale tubuli, opsamlingskanaler, glomeruli og sympatiske nerver i nyrerne på grund af manglen på tredimensionel (3D) information. Optisk clearing er en god strategi til at overvinde denne store forhindring. Flere celler i et helt organ kan analyseres ved enkeltcelleopløsning ved at kombinere vævsrensning og 3D-billeddannelsesteknik. Imidlertid forbliver cellemærkningsmetoder til helorganbilleddannelse underudviklede. Især er helmonteret organfarvning udfordrende på grund af vanskeligheden ved antistofindtrængning. Den nuværende protokol udviklede en helmonteret musenyrefarvning til 3D-billeddannelse med CUBIC (Clear, Unobstructed Brain / Body Imaging Cocktails and Computational analysis) vævsrensningsmetode. Protokollen har muliggjort visualisering af nyresympatisk denervation efter iskæmi-reperfusionsskade og glomerulomegali i det tidlige stadium af diabetisk nyresygdom fra et omfattende synspunkt. Således kan denne teknik føre til nye opdagelser inden for nyreforskning ved at give et makroskopisk perspektiv.
Introduction
Nyren består af forskellige cellepopulationer. Selvom konventionel patologi giver os meget information om nyremikromiljøet, er tredimensionel (3D) billeddannelse nødvendig for præcist at forstå den intercellulære krydstale under nyresygdomsprogression. Tidligere skulle der udføres et stort antal seriel sektionering og billedrekonstruktion til hele orglet 3D-billeddannelse1. Denne metode krævede imidlertid for meget indsats og havde problemer med hensyn til reproducerbarhed.
Optisk clearing er en god strategi til at overvinde denne forhindring 2,3. Vævsopacitet skyldes hovedsageligt lysspredning og absorption, fordi hvert organ består af forskellige stoffer, herunder vand, protein og lipider. Således erstatter den grundlæggende strategi for vævsrensning vand og lipider i væv med brydningsindeks (RI) matchende reagenser, der har de samme optiske egenskaber som proteiner4. For at observere en gennemsigtig prøve er en lysark fluorescerende mikroskopi nyttig5. Lysark belyser den gennemsigtige prøve fra siden, og excitationssignaler erhverves gennem objektivlinsen placeret i lodret position6. Denne mikroskopi opnår tværsnitsinformation i en enkelt fejning, som adskiller sig fra den konfokale eller multifoton fluorescerende mikroskopi. Således kan den hurtigt erhverve z-stack-billeder med et lavt niveau af fotobleaching.
Clear, Unobstructed Brain / Body Imaging Cocktails and Computational Analysis (CUBIC) er en af de vævsrensningsmetoder, der muliggør helorganbilleddannelse ved lysark fluorescerende mikroskopi 2,7,8. CUBIC og helmonteret immunfluorescerende farvning er optimeret i denne undersøgelse til at visualisere musenyre 3D-strukturer 9,10,11. Ved hjælp af denne helmonterede farvningsmetode visualiseres ændringen i nyresympatiske nerver efter iskæmi-reperfusionsskade 9,10 og glomerulomegali i det tidlige stadium af diabetisk nyresygdom 11 samt blodkar, proksimale tubuli og opsamlingskanaler i en hel nyre9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den nuværende protokol tillod 3D-billeddannelse af hele nyrerne af forskellige strukturer såsom sympatiske nerver, opsamlingskanaler, arterier, proksimale tubuli og glomeruli 9,10,11. Denne farvningsmetode tilbød makroskopisk observation og førte til nye biologiske opdagelser ved at visualisere ændringen i nyresympatiske nerver efter iskæmi-reperfusionsskade 9,10 og glomerulomegali i den …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
En del af dette arbejde blev udført gennem samarbejde med Prof. Hiroki R. Ueda (University of Tokyo), Prof. Etsuo A. Susaki (Juntendo University), Prof. Tetsuhiro Tanaka (Tohoku University), Prof. Masafumi Fukagawa, Dr. Takehiko Wada og Dr. Hirotaka Komaba (Tokai University).
Materials
| 14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube | Falcon | 352059 | Tissue clearing, staining, wash |
| 2,3-dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone/antipyrine | Tokyo Chemical Industry | D1876 | CUBIC-R+ |
| 37%-Formaldehyde Solution | Nacalai Tesque | 16223-55 | Post fixation |
| 4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Nacalai Tesque | 09154-85 | Kidney fixation |
| Alexa Flour 555-conjugated donkey anti-sheep IgG antibody | Invitrogen | A-21436 | Secondary antibody (1:100) |
| Alexa Flour 647-conjugated donkey anti-rabbit IgG antibody | Invitrogen | A-31573 | Secondary antibody (1:200) |
| Anti-aquaporin 2 (AQP2) antibody | Abcam | ab199975 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-podocin antibody | Sigma-Aldrich | P0372 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-sodium glucose cotransporter 2 (SGLT2) antibody | Abcam | ab85626 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-tyrosine hydroxylase (TH) antibody | Abcam | ab113 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-α-smooth muscle actin (α-SMA) antibody | Abcam | ab5694 | Primary antibody (1:200) |
| Blocker Casein in PBS | Thermo Fisher Scientific | 37528 | Staining buffer |
| Butorphanol Tartrate | Meiji | 005526 | Anesthetic |
| C57BL/6NJcl | Nippon Bio-Supp.Center | N/A | Mouse strain |
| Imaris | Bitplane | N/A | Imaging analysis software |
| Macro-zoom microscope | OLYMPUS | MVX10 | The observation unit of the custom-built microscope |
| Medetomidine Hydrochloride | Kyoritsu-Seiyaku | 008656 | Anesthetic |
| Midazolam | SANDOZ | 27803229 | Anesthetic |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Immersion oil |
| N-buthyldiethanolamine | Tokyo Chemical Industry | B0725 | CUBIC-L, CUBIC-R+ |
| Nicotinamide | Tokyo Chemical Industry | N0078 | CUBIC-R+ |
| Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether/Triton X-100 | Nacalai Tesque | 12967-45 | CUBIC-L, PBST |
| Silicon oil HIVAC-F4 | Shin-Etsu Chemical | 50449832 | Immersion oil |
| Sodium azide | Wako | 195-11092 | Staining buffer |
References
- Velez-Fort, M., et al. The stimulus selectivity and connectivity of layer six principal cells reveals cortical microcircuits underlying visual processing. Neuron. 83 (6), 1431-1443 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Tainaka, K., et al. Chemical Landscape for Tissue Clearing Based on Hydrophilic Reagents. Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
- Keller, P. J., Dodt, H. U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
- Hasegawa, S., et al. Comprehensive three-dimensional analysis (CUBIC-kidney) visualizes abnormal renal sympathetic nerves after ischemia/reperfusion injury. Kidney International. 96 (1), 129-138 (2019).
- Hasegawa, S., Inoue, T., Inagi, R. Neuroimmune interactions and kidney disease. Kidney Research and Clinical Practice. 38 (3), 282-294 (2019).
- Hasegawa, S., et al. The oral hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibitor enarodustat counteracts alterations in renal energy metabolism in the early stages of diabetic kidney disease. Kidney International. 97 (5), 934-950 (2020).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Hasegawa, S., et al. Activation of sympathetic signaling in macrophages blocks systemic inflammation and protects against renal ischemia-reperfusion injury. Journal of the American Society of Nephrology. 32 (7), 1599-1615 (2021).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Klingberg, A., et al. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
- Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812 (2020).
- Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11 (1), 1-22 (2020).
