JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

Выделение и анализ прослеживаемых и функционализированных внеклеточных везикул из плазмы и твердых тканей

Published: October 17, 2022
doi:
10.3791/63990
, , , , , , , ,
1State Key Laboratory of Military Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases & Shaanxi International Joint Research Center for Oral Diseases, Center for Tissue Engineering, School of Stomatology,The Fourth Military Medical University, 2Department of Orthodontics, School of Stomatology,The Fourth Military Medical University, 3Department of VIP Dental Care, School of Stomatology,The Fourth Military Medical University, 4School of Basic Medicine,The Fourth Military Medical University, 5College of Life Science,Northwest University, 6Xi’an Institute of Tissue Engineering and Regenerative Medicine

Summary

В настоящем протоколе описан способ извлечения внеклеточных везикул из периферической крови и солидных тканей с последующим профилированием поверхностных антигенов и белковых грузов.

Abstract

Циркулирующие и резидентные в тканях внеклеточные везикулы (ВВ) представляют собой многообещающие мишени в качестве новых тераностических биомаркеров, и они становятся важными игроками в поддержании гомеостаза организма и прогрессировании широкого спектра заболеваний. В то время как текущие исследования сосредоточены на характеристике эндогенных экзосом эндосомального происхождения, микровезикулы, выделяющиеся из плазматической мембраны, привлекают все большее внимание к здоровью и болезням, которые характеризуются обилием поверхностных молекул, повторяющих мембранную сигнатуру родительских клеток. Здесь представлена воспроизводимая процедура, основанная на дифференциальном центрифугировании для извлечения и характеристики EV из плазмы и твердых тканей, таких как кость. Далее в протоколе описывается последующее профилирование поверхностных антигенов и белковых грузов EV, которые, таким образом, прослеживаются на предмет их происхождения и идентифицируются с компонентами, связанными с потенциальной функцией. Этот метод будет полезен для коррелятивного, функционального и механистического анализа ЭВ в биологических, физиологических и патологических исследованиях.

Introduction

Внеклеточные везикулы (ВВ) были предложены для определения высвобождаемых клетками липидных двухслойных внеклеточных структур1, которые играют важную роль в различных физиологических и патологических событиях2. ЭВ, высвобождаемые здоровыми клетками, можно разделить на две основные категории, а именно экзосомы (или малые ВВ), образующиеся через внутриклеточный эндоцитарный путьтрафика 3 , и микровезикулы (или большие ЭВ), развивающиеся в результате почкования плазматической мембраны клетки4 наружу. В то время как многие исследования сосредоточены на функции ЭВ, собранных из культивируемых клеток in vitro5, ВВ, полученные из кровообращения или тканей, являются более сложными и неоднородными, что имеет то преимущество, что отражает истинное состояние организма in vivo6. Кроме того, почти все виды тканей могут продуцировать ЭВ in vivo , и эти ЭВ могут действовать как мессенджеры внутри ткани или переноситься различными жидкостями организма, особенно периферической кровью, для облегчения системной коммуникации7. ВВ в кровообращении и тканях также являются мишенями для диагностики и лечения заболеваний8.

В то время как экзосомы интенсивно изучались в последние годы, микровезикулы также обладают важными биологическими функциями, которые могут быть легко извлечены без ультрацентрифугирования, что способствует фундаментальным и клиническим исследованиям9. Примечательно, что критическая проблема, касающаяся EV, выделенных из кровообращения и тканей, заключается в том, что они получены из разных типов клеток10. Поскольку микровезикулы выводятся из плазматической мембраны и характеризуются обилием молекулклеточной поверхности 9, возможно использование маркеров родительской клеточной мембраны для идентификации клеточного происхождения этих EV. В частности, метод проточной цитометрии (FC) может быть применен для обнаружения мембранных маркеров. Кроме того, исследователи могут изолировать электромобили и проводить дальнейший анализ на основе функциональных грузов.

Настоящий протокол предусматривает тщательную процедуру извлечения и определения характеристик электромобилей из образцов in vivo. EV выделяют с помощью дифференциального центрифугирования, а характеристика EV включает морфологическую идентификацию с помощью анализа отслеживания наночастиц (NTA) и просвечивающей электронной микроскопии (TEM), анализ происхождения с помощью FC и анализ белкового груза с помощью вестерн-блоттинга. В качестве представителей используется плазма крови и верхнечелюстная кость мышей. Исследователи могут ссылаться на этот протокол для электромобилей из других источников и вносить соответствующие изменения.

Protocol

Эксперименты на животных проводились в соответствии с Руководством Комитета по уходу за животными и их использованию Четвертого военно-медицинского университета и руководящими принципами ARRIVE. Для настоящего исследования использовались 8-недельные мыши C57Bl / 6 (без предпочтения ни сам?…

Representative Results

Согласно экспериментальному рабочему процессу, ЭВ могут быть извлечены из периферической крови и твердых тканей (рис. 1). Верхнечелюстная кость мыши в возрасте 8 недель составляет примерно 0,1 ± 0,05 г, и у мыши можно собрать около 300 мкл плазмы. Следуя этапам протокола, можно …

Discussion

При изучении особенностей, судьбы и функций электромобилей крайне важно изолировать электромобили с высокой производительностью и низким уровнем загрязнения. Существуют различные методы извлечения EV, такие как центрифугирование в градиенте плотности (DGC), эксклюзионная хроматографи…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана грантами Национального фонда естественных наук Китая (32000974, 81870796, 82170988 и 81930025) и Китайского фонда постдокторантуры (2019M663986 и BX20190380). Мы благодарны за помощь Национальному экспериментально-учебному демонстрационному центру фундаментальной медицины (АМФУ).

Materials

4% paraformaldehyde  Biosharp 143174 Transmission electron microscope
Alexa fluor 488 anti-goat secondary antibody Yeason 34306ES60 Flow cytometry
Alexa fluor 488 anti-rabbit secondary antibody Invitrogen A11008 Flow cytometry
Anti-CD18 antibody Abcam ab131044 Flow cytometry
Anti-CD81 antibody Abcam ab109201 Western blot
anti-CD9 antibody Huabio ET1601-9 Western blot
Anti-Mitofilin antibody Abcam ab110329 Western blot
APOA1 Rabbit pAb Abclone A14211 Western blot
BCA protein assay kit TIANGEN PA115 Western blot
BLUeye Prestained Protein Ladder Sigma-Aldrich 94964-500UL Western blot
Bovine serum albumin MP Biomedical 218072801 Western blot
Caveolin-1 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-53564 Western blot
CellMask Orange plasma membrane stain Invitrogen C10045 Flow cytometry
Chemiluminescence Amersham Biosciences N/A Western blot
Curved operating scissor JZ Surgical Instrument J21040 EV isolation
Electronic balance Zhi Ke ZK-DST EV isolation
Epoch spectrophotometer BioTek N/A Western blot
Eppendorf tubes Eppendorf 3810X EV isolation
Flotillin-1 antibody PTM BIO PTM-5369 Western blot
Gel imaging system Tanon 4600 Western blot
Golgin84 Novus nbp1-83352 Western blot
Grids – Formvar/Carbon Coated – Copper 200 mesh Polysciences 24915 Transmission electron microscope
Heparin Solution StemCell  7980 EV isolation
Liberase Research Grade Sigma-Aldrich 5401127001 EV isolation
Microscopic tweezer JZ Surgical Instrument JD1020 EV isolation
NovoCyte flow cytometer ACEA N/A Flow cytometry
Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4~20%, 10 wells Epizyme LK206 Western blot
OSCAR(D-19) antibody Santa Cruz Biotechnology SC-34235 Flow cytometry
PBS (2x) ZHHC PW013 Western blot
Pentobarbital sodium Sigma-Aldrich 57-33-0 Anesthetization
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jacson 115-035-003 Western blot
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Jacson 111-035-003 Western blot
Phosphotungstic acid RHAWN 12501-23-4 Transmission electron microscope
PKM2(d78a4) xp rabbit  mab  Cell Signaling 4053t Western blot
Polyethylene (PE) film Xiang yi 200150055 Transmission electron microscope
Polyvinylidene fluoride membranes  Roche 3010040001 Western blot
Protease inhibitors Roche 4693132001 Western blot
Recombinant anti-PGD antibody Abcam ab129199 Western blot
RIPA lysis buffer Beyotime P0013 Western blot
SDS-PAGE loading buffer (5x) Cwbio CW0027S Western blot
Size beads Invitrogen F13839 Flow cytometry
Tabletop High-Speed Micro Centrifuges Hitachi CT15E EV isolation
Transmission electron microscope HITACHI H-7650 Transmission electron microscope
Tween-20 MP Biomedicals 19472 Western blot
Vortex Mixer Genie Scientific Industries SI0425 EV isolation
ZetaView BASIC NTA – Nanoparticle Tracking Video Microscope PMX-120 Particle Metrix N/A Nanoparticle tracking analysis
α-Actinin-4 Rabbit mAb Abclone A3379 Western blot
β-actin Cwbio CW0096M Western blot
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to extracellular vesicles: biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake. Cellular and Molecular Neurobiology. 36 (3), 301-312 (2016).
  2. Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
  3. Van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
  4. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360 (2013).
  5. Keshtkar, S., Azarpira, N., Ghahremani, M. H. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: novel frontiers in regenerative medicine. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 63 (2018).
  6. Thietart, S., Rautou, P. E. Extracellular vesicles as biomarkers in liver diseases: A clinician’s point of view. Journal of Hepatology. 73 (6), 1507-1525 (2020).
  7. Xia, W., et al. Damaged brain accelerates bone healing by releasing small extracellular vesicles that target osteoprogenitors. Nature Communications. 12 (1), 6043 (2021).
  8. In’t Veld, S. G. J. G., Wurdinger, T. Tumor-educated pletelets. Blood. 133 (22), 2359-2364 (2019).
  9. Schwager, S. C., Reinhart-King, C. A. Mechanobiology of microvesicle release, uptake, and microvesicle-mediated activation. Current Topics in Membranes. 86, 255-278 (2020).
  10. Brahmer, A., et al. endothelial cells and leukocytes contribute to the exercise-triggered release of extracellular vesicles into the circulation. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1615820 (2019).
  11. Yang, H., et al. Blood collection through subclavian vein puncture in mice. Journal of Visualized Experiments. (147), e59556 (2019).
  12. Han, L., Lam, E. W., Sun, Y. Extracellular vesicles in the tumor microenvironment: old stories, but new tales. Molecular Cancer. 18 (1), 59 (2019).
  13. Gelibter, S., et al. The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162 (2022).
  14. Forsyth, C. B., Mathews, H. L. Lymphocytes utilize CD11b/CD18 for adhesion to Candida albicans. Cellular Immunology. 170 (1), 91-100 (1996).
  15. Kodama, J., Kaito, T. Osteoclast multinucleation: review of current literature. International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 5685 (2020).
  16. Welsh, J. A., et al. MIFlowCyt-EV: a framework for standardized reporting of extracellular vesicle flow cytometry experiments. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1713526 (2020).
  17. Durcin, M., et al. Characterisation of adipocyte-derived extracellular vesicle subtypes identifies distinct protein and lipid signatures for large and small extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1305677 (2017).
  18. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).
  19. Noren Hooten, N., et al. Association of extracellular vesicle protein cargo with race and clinical markers of mortality. Scientific Reports. 9 (1), 17582 (2019).
  20. Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. A review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466 (2020).
  21. Pietrowska, M., Wlosowicz, A., Gawin, M., Widlak, P. MS-based proteomic analysis of serum and plasma: problem of high abundant components and lights and shadows of albumin removal. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1073, 57-76 (2019).
  22. Coumans, F., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
  23. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  24. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360 (2013).
  25. Coumans, F., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
  26. Görgens, A., et al. Identification of storage conditions stabilizing extracellular vesicles preparations. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (6), 12238 (2020).
  27. Maroto, R., et al. Effects of storage temperature on airway exosome integrity for diagnostic and functional analyses. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1359478 (2017).
  28. Zheng, C., et al. Apoptotic vesicles restore liver macrophage homeostasis to counteract type 2 diabetes. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (7), 12109 (2021).
  29. Liu, D., et al. Circulating apoptotic bodies maintain mesenchymal stem cell homeostasis and ameliorate osteopenia via transferring multiple cellular factors. Cell Research. 28 (9), 918-933 (2018).
  30. Vander Pol, E., van Gemert, M. J., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 10 (5), 919-930 (2012).
  31. Dawson, G. Isolation of lipid rafts (detergent-resistant microdomains) and comparison to extracellular vesicles (exosomes). Methods in Molecular Biology. 2187, 99-112 (2021).
  32. Zhang, G., et al. Extracellular vesicles: Natural liver-accumulating drug delivery vehicles for the treatment of liver diseases. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (2), 12030 (2020).
  33. Vella, L. J., et al. A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885 (2017).

Tags

Extracellular VesiclesIsolationAnalysisPlasmaSurface AntigensProtein CargoesFlow CytometryMaxillary BoneLiberaseCentrifugationPBSSample Processing
check_url/it/63990?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Cao, Y., Qiu, J., Chen, D., Li, C., Xing, S., Zheng, C., Liu, X., Jin, Y., Sui, B. Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues. J. Vis. Exp. (188), e63990, doi:10.3791/63990 (2022).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image