Kas hasarı riski azaltılmış farelerde dozaj ayarlı direnç eğitimi
Summary
Mevcut protokol, fareler gibi küçük hayvanlarda gerçekleştirilen hassas rehabilitasyon çalışmalarına dahil edilebilen dozaj ayarlı direnç eğitimi (DART) adı verilen benzersiz bir tekniği tanımlamaktadır.
Abstract
Giderek daha büyük dış yüklere karşı kas kasılmaları gerçekleştirmeyi içeren ilerleyici direnç eğitimi (PRT), sağlıklı bireylerde ve hasta popülasyonlarında kas kütlesini ve gücünü artırabilir. Küçük ve büyük hayvan modelleri üzerinde yapılan klinik öncesi çalışmalarda kas kütlesini ve gücünü korumak ve / veya geri kazanmak için İİT’nin güvenliğini ve etkinliğini test etmek için hassas rehabilitasyon araçlarına ihtiyaç vardır. Bu makalede açıklanan PRT metodolojisi ve cihazı, dozaj ayarlı direnç eğitimi (DART) gerçekleştirmek için kullanılabilir. DART cihazı, farelerde ayak bileği dorsifleksörleri tarafından üretilen konsantrik kontraktil torku objektif olarak değerlendirmek için bağımsız bir dinamometre olarak kullanılabilir veya önceden var olan bir izokinetik dinamometri sistemine eklenebilir. DART cihazı, bu çalışmada sağlanan talimatlara ve açık kaynaklı 3D baskı dosyalarına dayanan standart bir 3D yazıcı ile üretilebilir. Makale ayrıca, tek bir DART nöbetinin neden olduğu kasılmaya bağlı kas hasarını, uzuv-kuşak kas distrofisi tip 2B / R2’nin (BLAJ fareleri) bir fare modelinde karşılaştırılabilir bir izometrik kasılma nöbetinin (ISOM) neden olduğu kas hasarı ile karşılaştırmak için bir çalışmanın iş akışını da açıklamaktadır. Sekiz BLAJ faresinden elde edilen veriler (her durum için dört hayvan), tibialis anterior (TA) kasının % 10’undan azının tek bir DART veya ISO nöbetinden zarar gördüğünü ve DART’ın ISOM’dan daha az zararlı olduğunu göstermektedir.
Introduction
Egzersiz, iskelet kası üzerinde çok sayıda sağlık yararı sağlar (Vina ve ark.1’de gözden geçirilmiştir). Spesifik olarak, giderek daha büyük dış yüklere (örneğin, halterler, dambıllar, kablo kasnak ağırlık devreleri) karşı kas kasılmaları gerçekleştirmeyi içeren ilerleyici direnç eğitiminin (PRT), hem sağlıklı bireylerde hem de hasta popülasyonlarında kas kütlesini ve gücünü artırmaya yardımcı olduğu bilinmektedir (önceki yayınlarda gözden geçirilmiştir 2,3 ). PRT, kasın giderek daha büyük dış yüklere karşı büzüldüğü zaman, fizyolojik kesit alanını ve kuvvet üretme kapasitesini artırarak adapte olduğunu belirten aşırı yük prensibine dayanmaktadır4. Kemirgenlerde mevcut İİT modelleri arasında kuyruğa uygulanan dirençle merdiven tırmanma, agonist kasların antagonistlerden gelen dirence karşı birlikte kasılması, ağırlıklı bir koşum takımı ile koşma, elektrik çarpması sonucu ortaya çıkan bir çömelme egzersizi ve dirençli tekerlek çalıştırma 5,6,7,8,9,10 (önceki yayınlarda gözden geçirilmiştir 11,12 ). Bununla birlikte, şu anda farelerde tam olarak kas hedefli, dozaj ayarlı PRT’yi gerçekleştirmek için insan klinik araştırmalarında ve uygulamalarında kullanılan PRT yöntemlerine ve cihazlarına çok benzeyen hiçbir araştırma aracı yoktur12,13. Bu, araştırmacıların farelerde temel ve klinik öncesi çalışmalarda tam olarak dozlanmış PRT’nin güvenliğini ve etkinliğini inceleme yeteneğini sınırlar.
Bu engeli aşmak için bu çalışmada, modern spor salonlarında direnç antrenman ekipmanlarında kullanılan kablo-kasnak-ağırlık devresi tasarımlarına dayanan bir İİT metodolojisi ve cihazı geliştirilmiştir14,15,16. Bu PRT yöntemi, dozaj ayarlı direnç eğitimi (DART) olarak adlandırılır ve cihaza DART cihazı denir. Hassas bir rehabilitasyon eğitim aracı olarak işlevselliğine ek olarak, DART cihazı, bir faredeki tibialis anterior (TA) kası tarafından üretilebilecek maksimum eşmerkezli kontraktil torku objektif olarak değerlendirmek için bağımsız bir araç olarak da kullanılabilir, tıpkı tek tekrarlı maksimumun (1RM, iyi formu korurken sadece bir kez başarılı bir şekilde kaldırılabilen / taşınabilen / basılabilen / çömelebilen maksimum yük) insanlarda nasıl değerlendirildiğine benzer17, 18. DART cihazı ayrıca, bir faredeki TA kası tarafından üretilen tepe izometrik tetanik kuvvetini ölçmek için özel yapım veya ticari bir izokinetik dinamometre ile birleştirilebilir (insanlarda maksimum gönüllü kasılma [MVC] ile karşılaştırılabilir) ve daha sonra pik tetanik kuvvete (örneğin, tepe kuvvetinin% 50’si) dayanan bir dirençle dozaj ayarlı PRT gerçekleştirebilir.
Bu makalede, DART cihazının yapısı açıklanmakta ve kontraktil torku değerlendirmek ve DART’ı gerçekleştirmek için önceki yayınlar 19,20,21,22’de açıklanan özel yapım bir dinamometre ile nasıl birleştirilebileceği açıklanmaktadır. Çalışma ayrıca, DART cihazının, tek bir DART nöbetinin (% 50 1RM ile 10 konsantrik önyargılı kasılmanın 4 seti) neden olduğu egzersize bağlı kas hasarını, uzuv-kuşak kas distrofisi tip 2B’nin bir fare modelinde (LGMD2B, veya LGMDR2)23,24. İncelenen fare modeli, iskelet kasını zararlı eksantrik kasılmaların ardından gecikmiş başlangıçlı kas hasarına karşı korumada önemli bir rol oynayan disferlin adı verilen bir proteinden yoksundur 22,25,26,27,28,29,30 . Ayrıca, disferlin eksikliği olan erkek farelerde, konsantrik olarak önyargılı zorla egzersizin, eksantrik olarak önyargılı zorla egzersiz kadar zararlı olmadığı ve konsantrik olarak önyargılı eğitime daha önce maruz kalmanın, sonraki eksantrik önyargılı kasılmalardan kaynaklanan yaralanmalara karşı koruma sağladığı gösterilmiştir22. Mevcut çalışma, mevcut DART metodolojisinin ve cihazının dozaj ayarlı, konsantrik olarak önyargılı direnç eğitimi gerçekleştirmedeki fizibilitesini test etmek için yapıldığından, DART cihazından elde edilen yeni verileri önceki verilerle karşılaştırmak için araştırma için erkek disferlin eksikliği olan fareler seçilmiştir. Gelecekteki çalışmalarda, cinsiyetin DART’a verilen yanıtla ilgili biyolojik bir değişken olarak etkisini incelemek için dişi BLAJ fareleri dahil edilecektir. ~ 1.5 yaşında olan fareler, birçok kas grubunda zaten distrofik değişikliklere sahip oldukları için incelenmiştir ve bu nedenle, kas zayıflığı ve israfı olan ve kas kütlesini ve gücünü korumak için rehabilite edici bakım arayan hastalarda kasların olabileceği patofizyolojik durumu modellemektedir26.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makalede, dozaj ayarlı direnç eğitimi (DART) adı verilen bir tür hassas rehabilitasyon eğitimi gerçekleştirmek için bir cihazın nasıl oluşturulacağına ilişkin adım adım talimatlar sunulmaktadır. Çalışma ayrıca, DART cihazının ve metodolojisinin, tek bir DART (DART grubu) nöbetinden 3 gün sonra kas hasarını, karşılaştırılabilir bir izometrik eğitim (ISOM grubu) döneminden 3 gün sonra hasarla karşılaştırmak için bir eğitim çalışmasında uygulanmasını da açıklamaktadır.</…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Jain Foundation Inc., NICHD’den R03HD091648, NIH P2CHD086843 kapsamında AR3T’den bir Pilot Hibe, Wayne State Üniversitesi’nde EACPHS’den bir FRAP Ödülü, Wayne State Üniversitesi’nden bir Fakülte Başlangıç Paketi ve 1R01AR079884-01’den (Peter L. Jones PI) JAR’a bir taşeron tarafından finanse edilmiştir. Bu çalışma aynı zamanda JMB, MEP ve JAR’a Amerikan Fizik Tedavi Derneği – Michigan (APTA-MI) araştırma hibesi tarafından finanse edildi. Yazarlar, Dr. Renuka Roche’a (Doçent, Eastern Michigan University, MI) makaleyi eleştirel olarak okuduğu ve geri bildirim sağladığı için teşekkür eder. Yazarlar, 3D baskı konusunda tavsiye için Bay Anselm D. Motha’ya teşekkür ediyor. Yazarlar, hikayelerini https://www.jain-foundation.org/patient-physician-resources/patient-stories’daki Jain Vakfı web sitesinde paylaşan disferlinopatili hastalara, özellikle de egzersizle ilgili deneyimlerini teşekkür ediyor.
Materials
| AnMiao Star 608 Ceramic Ball Bearing | Anmiao Star (N/A) | AMS127 | High precision, low friction wheel bearing. If make and model is not commercially available, an alternative version of a 608 low-friction wheel bearing, 8 mm bore diameter, 22 mm outside diameter, with silicon nitride ceramic balls in 420 stainless steel housing should suffice. Excess friction in the wheel bearing will adversely impact performance of the DART device and will increase overall resistance to muscle contractions. |
| Axio Scope.A1 microscope | Carl Zeiss (Peabody, MA) | Product #Axio Scope.A1 | Light and fluorescence microscope |
| B6.A-Dysfprmd/GeneJ (a.k.a. BLAJ mice) | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Special colony maintained by The Jain Foundation Inc. for collaborators who study dysferlin. | Stock #012767 | Dysferlin deficient mice that model human limb girdle muscular dystrophy type 2B/R2. |
| Bipolar, transcutaneous, neuromuscular electrical stimulation (NMES) electrode | Harvard Apparatus, Holliston, MA | BS4 50–6824 | Electrode for NMES. If this electrode is not commercially available, please contact corresponding author for alternatives. |
| Coplin Staining Dish | ThermoFisher (Waltham, MA) | Catalog No. S17495 | Staining dish/jar for hematoxylin and eosin (H&E) staining of sections |
| Cura 4.4.1. Software | Ultimaker, Utrecht, Netherlands | Ultimaker Cura 4.4.1. | Slicing software to convert stereolithography files into G-CODE files |
| Deltaphase isothermal gel heating pad | Braintree Scientific (Braintree, MA) | Item #39DP | Heating pad to provide thermal support to animals while under anesthesia |
| Eosin Y | Millipore Sigma (Burlington, MA) | HT110132-1L | Pink cytoplasmic stain |
| Gorilla Super Glue | The Gorilla Glue Company (Cincinnati, OH) | Gorilla Super Glue Micro Precise | Cyanoacrylate adhesive to bond PLA components |
| Hematoxylin solution, Gill No.3 | Millipore Sigma (Burlington, MA) | GHS332-1L | Dark blue stain for nuclei |
| HM525NX cryostat | ThermoFisher (Waltham, MA) | Catalog #HM525NX | Cryostat to make frozen sections of muscle |
| Lab Wipes. Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | ThermoFisher (Waltham, MA) | Catalog No. 06-666. Manufacturer #34120 | Laboratory wipes to blot mineral oil from muscle tissue before snap freezing and for other purposes. |
| Labview 2014 | National Instruments, Austin, Texas, USA | Labview 2014 | Software for custom-written programs/routines that operate the dynamometer and trigger the NMES stimulator. |
| Liquid nitrogen HDPE Dewar Flasks | ThermoFisher (Waltham, MA) | S34074B. Thermo Scientific 41502000/EMD | Flask to hold liquid nitrogen for snap freezing muscle or other tissue |
| Magic depilatory cream | Softsheen Carson (New York, NY) | N/A | Razorless hair removal cream |
| Metal alligator clip | JINSHANGTOPK (web-based business) | 24Pcs 51mm Metal Alligator Clip Spring Clamps | Spring clamp to hold tibial pin |
| Micrscope slides | Globe Scientific (Mahwah, NJ) | 1354W. Diamond White Glass Slides | Charged microscope slides |
| Mineral Oil | ThermoFisher (Waltham, MA) | BP26291 | Mineral oil to cryoprotect muscle tissue before snap freezing |
| Monoprice Premium 3D Printer Filament PLA | Monoprice (Rancho Cucamonga, CA) | #11778 | Premium 3D Printer Filament PLA 1.75mm 1 kg/spool, Gray. This is the material used to 3D print device components. |
| Monoprice Select Mini V2 3D printer | Monoprice (Rancho Cucamonga, CA) | Mini V2 3D | 3D printer for computer-aided fabrication of device components. |
| NIH Image software | National Instritues of Health (NIH, Bethesda, MD) | NIH Image for Windows | Image processing and analysis software used to quantify area of muscle damage. NIH Image is also known as Image J. |
| Photoshop CS4 | Adobe (San Jose, CA) | Creative Suite (CS4). 64 bit version for Windows | Image processing and analysis software used to generate tiled/stiched images of entire muscle cross-section from images of indvidual overlapping fields |
| PSIU6 stimulation isolation unit | Grass Instruments (West Warwick, RI) | PSIU6 isolation unit | Isolation unit for NMES. Stimulators, such as Model 4100 from A-M come with a built in stimulation isoloation unit |
| Roboz 4-0 silk black braided suture material | Roboz Surgical (Gaithersburg, MD) | Roboz Surgical SUT152 | Suture material to connect DART device footplate to dynamometer footplate or resistance for resistance training |
| S48 square pulse stimulator | Grass Instruments (West Warwick, RI) | S48 Stimulator | Laboratory electrical stimulator for NMES . If this stimulator is not commercially available, Model 4100 Isolated High Power Stimulator from A-M systems could be an alternative. Please contact co-author Jones for more information. |
| Scott’s bluing reagent | Ricca Chemical Company (Arlington, TX) | 6697-32 | Bluing solution that intensifies hematoxylin nuclear staining |
| SigmaStat version 3.5 | Systat Software (San Jose, CA) | SigmaStat version 3.5 | Statistical software package for statistical analyses |
| Tabletop isoflurane vaporizer | VetEquip (Livermore, CA) | Item #901801 | Inhaled tabletop anesthesia system |
| Triple antibiotic first aid ointment | Global Health Products (wed-based business) | Globe Triple Antibiotic First Aid Ointment, 1 oz (2-Pack) First Aid Antibiotic Ointment | Antibiotic ointment applied on tibial pin as part of post-procedural care |
Riferimenti
- Vina, J., Sanchis-Gomar, F., Martinez-Bello, V., Gomez-Cabrera, M. C. Exercise acts as a drug; The pharmacological benefits of exercise. British Journal of Pharmacology. 167 (1), 1-12 (2012).
- Murton, A. J., Greenhaff, P. L. Resistance exercise and the mechanisms of muscle mass regulation in humans: Acute effects on muscle protein turnover and the gaps in our understanding of chronic resistance exercise training adaptation. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (10), 2209-2214 (2013).
- Pepin, M. E., Roche, J. A., Malek, M. H., Chandler, T. J., Brown, L. E. Strength Training for Special Populations. Conditioning for Strength and Human Performance. , 547-570 (2019).
- Helland, C., et al. Training strategies to improve muscle power: Is Olympic-style weightlifting relevant. Medicine and Science in Sports and Exercise. 49 (4), 736-745 (2017).
- Souza, M. K., et al. l-Arginine supplementation blunts resistance exercise improvement in rats with chronic kidney disease. Life Sciences. 232, 116604 (2019).
- Schmoll, M., et al. SpillOver stimulation: A novel hypertrophy model using co-contraction of the plantar-flexors to load the tibial anterior muscle in rats. PloS One. 13 (11), 0207886 (2018).
- Adams, G. R., Haddad, F., Bodell, P. W., Tran, P. D., Baldwin, K. M. Combined isometric, concentric, and eccentric resistance exercise prevents unloading-induced muscle atrophy in rats. Journal of Applied Physiology. 103 (5), 1644-1654 (2007).
- Guedes, J. M., et al. Muscular resistance, hypertrophy and strength training equally reduce adiposity, inflammation and insulin resistance in mice with diet-induced obesity. Einstein. 18, (2019).
- Zhu, W. G., et al. Weight pulling: A novel mouse model of human progressive resistance exercise. Cells. 10 (9), 2459 (2021).
- Call, J. A., McKeehen, J. N., Novotny, S. A., Lowe, D. A. Progressive resistance voluntary wheel running in the mdx mouse. Muscle & Nerve. 42 (6), 871-880 (2010).
- Strickland, J. C., Smith, M. A. Animal models of resistance exercise and their application to neuroscience research. Journal of Neuroscience Methods. 273, 191-200 (2016).
- Greising, S. M., Basten, A. M., Schifino, A. G., Call, J. A., Greising, S. M., Call, J. A. Considerations for Small Animal Physical Rehabilitation. Regenerative Rehabilitation: From Basic Science to the Clinic. , 39-59 (2022).
- Roche, J. A., Greising, S. M., Call, J. A. Regenerative Rehabilitation for Nonlethal Muscular Dystrophies. Regenerative Rehabilitation: From Basic Science to the Clinic. , 61-84 (2022).
- Schott, N., Johnen, B., Holfelder, B. Effects of free weights and machine training on muscular strength in high-functioning older adults. Experimental Gerontology. 122, 15-24 (2019).
- . Dr. Gustav Zander’s Victorian-Era Exercise Machines Made the Bowflex Look Like Child’s Play Available from: https://www.smithsonianmag.com/smithsonian-institution/gustav-zander-victorian-era-exercise-machines-bowflex-180957758/ (2016)
- Hansson, N., Ottosson, A. Nobel prize for physical therapy? Rise, fall, and revival of medico-mechanical institutes. Physical Therapy. 95 (8), 1184-1194 (2015).
- ACSM. American College of Sports Medicine position stand. Progression models in resistance training for healthy adults. Medicine and Science in Sports and Exercise. 41 (3), 687-708 (2009).
- Suchomel, T. J., Nimphius, S., Bellon, C. R., Hornsby, W. G., Stone, M. H. Training for muscular strength: Methods for monitoring and adjusting training intensity. Sports Medicine. 51 (10), 2051-2066 (2021).
- Bloch, R. J., et al. Small-Animal Unit for Muscle Injury, Muscle Testing and Muscle Training in Vivo. US Patent. , (2012).
- Lovering, R. M., Roche, J. A., Goodall, M. H., Clark, B. B., McMillan, A. An in vivo rodent model of contraction-induced injury and non-invasive monitoring of recovery. Journal of Visualized Experiments. (51), e2782 (2011).
- Begam, M., et al. Diltiazem improves contractile properties of skeletal muscle in dysferlin-deficient BLAJ mice, but does not reduce contraction-induced muscle damage. Physiological Reports. 6 (11), 13727 (2018).
- Begam, M., et al. The effects of concentric and eccentric training in murine models of dysferlin-associated muscular dystrophy. Muscle and Nerve. 62 (3), 393-403 (2020).
- Straub, V., Murphy, A., Udd, B. 229th ENMC international workshop: Limb girdle muscular dystrophies – Nomenclature and reformed classification Naarden, the Netherlands. Neuromuscular Disorders. 28 (8), 702-710 (2018).
- . DYSFERLIN Available from: https://www.omim.org/entry/603009 (2021)
- Millay, D. P., et al. Genetic manipulation of dysferlin expression in skeletal muscle: Novel insights into muscular dystrophy. American Journal of Pathology. 175 (5), 1817-1823 (2009).
- Nagy, N., et al. Hip region muscular dystrophy and emergence of motor deficits in dysferlin-deficient Bla/J mice. Physiological Reports. 5 (6), 13173 (2017).
- Roche, J. A., Lovering, R. M., Bloch, R. J. Impaired recovery of dysferlin-null skeletal muscle after contraction-induced injury in vivo. Neuroreport. 19 (16), 1579-1584 (2008).
- Roche, J. A., et al. Extensive mononuclear infiltration and myogenesis characterize recovery of dysferlin-null skeletal muscle from contraction-induced injuries. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 298 (2), 298-312 (2010).
- Roche, J. A., Ru, L. W., Bloch, R. J. Distinct effects of contraction-induced injury in vivo on four different murine models of dysferlinopathy. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 134031 (2012).
- Roche, J. A., et al. Myofiber damage precedes macrophage infiltration after in vivo injury in dysferlin-deficient A/J mouse skeletal muscle. American Journal of Pathology. 185 (6), 1686-1698 (2015).
- Ingalls, C. P., Warren, G. L., Zhang, J. Z., Hamilton, S. L., Armstrong, R. B. Dihydropyridine and ryanodine receptor binding after eccentric contractions in mouse skeletal muscle. Journal of Applied Physiology. 96 (5), 1619-1625 (2004).
- Dutton, M. . Orthopaedics for the Physical Therapist Assistant. , 238 (2011).
- Begam, M., Abro, V. M., Mueller, A. L., Roche, J. A. Sodium 4-phenylbutyrate reduces myofiber damage in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Applied Physiology, Nutrition, and Metabolism. Physiologie Appliquée, Nutrition et Métabolisme. 41 (10), 1108-1111 (2016).
- Tully, J. J., Meloni, G. N. A scientist’s guide to buying a 3D printer: How to choose the right printer for your laboratory. Analytical Chemistry. 92 (22), 14853-14860 (2020).
- Schwiening, C. 3D printing primer for physiologists. Physiology News. (101), (2015).
- Begam, M., Roche, J. A. Damaged muscle fibers might masquerade as hybrid fibers – A cautionary note on immunophenotyping mouse muscle with mouse monoclonal antibodies. European Journal of Histochemistry. 62 (3), 2896 (2018).
- Lott, D. J., et al. Safety, feasibility, and efficacy of strengthening exercise in Duchenne muscular dystrophy. Muscle & Nerve. 63 (3), 320-326 (2021).
- Lindsay, A., Larson, A. A., Verma, M., Ervasti, J. M., Lowe, D. A. Isometric resistance training increases strength and alters histopathology of dystrophin-deficient mouse skeletal muscle. Journal of Applied Physiology. 126 (2), 363-375 (2019).
- Dalkin, W., Taetzsch, T., Valdez, G. The fibular nerve Injury method: A reliable assay to identify and test factors that repair neuromuscular junctions. Journal of Visualized Experiments. (114), e54186 (2016).
- Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936 (2016).
- Gerlinger-Romero, F., et al. Non-invasive assessment of dorsiflexor muscle function in mice. Journal of Visualized Experiments. (143), e58696 (2019).
- Brightwell, C. R., et al. In vivo measurement of knee extensor muscle function in mice. Journal of Visualized Experiments. (169), e62211 (2021).
- Pratt, S. J. P., Lawlor, M. W., Shah, S. B., Lovering, R. M. An in vivo rodent model of contraction-induced injury in the quadriceps muscle. Injury. 43 (6), 788-793 (2012).
- Shields, R. K. Precision rehabilitation: How lifelong healthy behaviors modulate biology, determine health, and affect populations. Physical Therapy. 102 (1), 248 (2022).
- . Medical Rehabilitation Research Resource Network (MR3N). Precision Rehabilitation – Inaugural Scientific Retreat Available from: https://ncmrr.org/education-training/archived-presentations/precision-rehab-archive (2021)
- Roche, J. A., et al. Minimally invasive muscle embedding generates donor-cell-derived muscle fibers that express desmin and dystrophin. Military Medicine. 185, 423-429 (2020).
- Roche, J. A., et al. Minimally invasive muscle embedding (MIME), facilitates the development of functional muscle fibers of human cadaveric origin, in host mice. The FASEB Journal. 33, 602 (2019).
