Hi-C 3.0 est un protocole Hi-C amélioré qui combine des agents de réticulation du formaldéhyde et du glutarate de disuccinimidyl avec un cocktail d’enzymes de restriction DpnII et DdeI pour augmenter le rapport signal sur bruit et la résolution de la détection des interactions chromatines.
La capture de conformation chromosomique (3C) est utilisée pour détecter les interactions tridimensionnelles de la chromatine. Typiquement, la réticulation chimique avec le formaldéhyde (FA) est utilisée pour fixer les interactions de la chromatine. Ensuite, la digestion de la chromatine avec une enzyme de restriction et la ligature subséquente des extrémités des fragments convertissent la proximité tridimensionnelle (3D) en produits de ligature uniques. Enfin, après l’inversion des réticulations, l’élimination des protéines et l’isolement de l’ADN, l’ADN est cisaillé et préparé pour le séquençage à haut débit. La fréquence de ligature de proximité des paires de loci est une mesure de la fréquence de leur colocalisation dans l’espace tridimensionnel dans une population cellulaire.
Une bibliothèque Hi-C séquencée fournit des informations à l’échelle du génome sur les fréquences d’interaction entre toutes les paires de loci. La résolution et la précision de Hi-C reposent sur une réticulation efficace qui maintient les contacts de la chromatine et la fragmentation fréquente et uniforme de la chromatine. Cet article décrit un protocole Hi-C in situ amélioré, Hi-C 3.0, qui augmente l’efficacité de la réticulation en combinant deux agents de réticulation (formaldéhyde [FA] et glutarate de disuccinimidyl [DSG]), suivi d’une digestion plus fine à l’aide de deux enzymes de restriction (DpnII et DdeI). Hi-C 3.0 est un protocole unique pour la quantification précise des caractéristiques de repliement du génome à des échelles plus petites telles que les boucles et les domaines d’association topologique (TAD), ainsi que des caractéristiques à des échelles plus grandes à l’échelle du noyau telles que les compartiments.
La capture de conformation chromosomique est utilisée depuis 20021. Fondamentalement, chaque variante de capture de conformation repose sur la fixation des interactions ADN-protéine et protéine-protéine pour préserver l’organisation de la chromatine 3D. Ceci est suivi par la fragmentation de l’ADN, généralement par la digestion de restriction, et, enfin, la ligature des extrémités d’ADN proches pour convertir les loci spatialement proximaux en séquences d’ADN covalentes uniques. Les protocoles 3C initiaux utilisaient la PCR pour échantillonner des interactions spécifiques « un-à-un ». Les tests 4C ultérieurs ont permis de détecter les interactions « un-à-tous »2, tandis que 5C a détecté les interactions « plusieurs-à-plusieurs »3. La capture de la conformation chromosomique a porté ses fruits après la mise en œuvre du séquençage à haut débit (NGS) de nouvelle génération, qui a permis de détecter des interactions génomiques « tout-à-tous » en utilisant Hi-C4 à l’échelle du génome et des techniques comparables telles que 3C-seq5, TCC6 et Micro-C 7,8 (voir également l’examen de Denker et De Laat9).
Dans Hi-C, des nucléotides biotinylés sont utilisés pour marquer les surplombs 5′ après digestion et avant ligature (Figure 1). Cela permet de sélectionner des fragments correctement digérés et religués à l’aide de billes enrobées de streptavidine, ce qui les distingue de GCC10. Une mise à jour importante du protocole Hi-C a été mise en œuvre par Rao et coll.11, qui ont effectué la digestion et la ligature dans des noyaux intacts (c.-à-d. in situ) afin de réduire les faux produits de ligature. De plus, le remplacement de la digestion HindIII par la digestion MboI (ou DpnII) a réduit la taille des fragments et augmenté le potentiel de résolution de l’Hi-C. Cette augmentation a permis la détection de structures à relativement petite échelle et une localisation génomique plus précise des points de contact, tels que les boucles d’ADN entre petits éléments cis, par exemple les boucles entre les sites liés à la CTCF générées par l’extrusion de boucles11,12. Cependant, ce potentiel a un coût. Premièrement, une multiplication par deux de la résolution nécessite une multiplication par quatre (22) des lectures de séquençage13. Deuxièmement, les petites tailles de fragments augmentent la possibilité de confondre les fragments voisins non digérés avec les fragments digérés et relidés14. Comme mentionné, dans Hi-C, les fragments digérés et religués diffèrent des fragments non digérés par la présence de biotine à la jonction de ligature. Cependant, une élimination appropriée de la biotine des extrémités non ligaturées est nécessaire pour s’assurer que seules les jonctions de ligature sont abaissées14,15.
Avec la diminution du coût du NGS, il devient possible d’étudier le repliement des chromosomes plus en détail. Pour diminuer la taille des fragments d’ADN, et ainsi augmenter la résolution, le protocole Hi-C peut être adapté pour utiliser plus fréquemment des enzymes de restriction de coupe16 ou pour utiliser des combinaisons d’enzymes de restriction17,18,19. Alternativement, MNase 7,8 dans Micro-C et DNase dans DNase Hi-C20 peuvent être titrés pour obtenir une digestion optimale.
Une évaluation systématique récente des principes fondamentaux des méthodes 3C a montré que la détection des caractéristiques de repliement des chromosomes à chaque échelle de longueur s’améliorait considérablement avec la réticulation séquentielle avec 1% FA suivi de 3 mM DSG17. De plus, Hi-C avec digestion HindIII était la meilleure option pour détecter les caractéristiques de pliage à grande échelle, telles que les compartiments, et que Micro-C était supérieur pour détecter les caractéristiques de repliement à petite échelle telles que les boucles d’ADN. Ces résultats ont conduit au développement d’une stratégie unique et haute résolution « Hi-C 3.0 », qui utilise la combinaison de réticulateurs FA et DSG suivie d’une double digestion avec les endonucléases DpnII et DdeI21. Hi-C 3.0 fournit une stratégie efficace pour une utilisation générale car il détecte avec précision les caractéristiques de pliage sur toutes les échelles de longueur17. La partie expérimentale du protocole Hi-C 3.0 est détaillée ici et les résultats typiques auxquels on peut s’attendre après le séquençage sont présentés.
Figure 1 : Procédure Hi-C en six étapes. Les cellules sont fixées d’abord avec FA, puis DSG (1). Ensuite, la lyse précède une double digestion avec DdeI et DpnII (2). La biotine est ajoutée par remplissage en surplomb et les extrémités émoussées proximales sont ligaturées (3) avant la purification de l’ADN (4). La biotine est retirée des extrémités non ligaturées avant la sonication et la sélection de la taille (5). Enfin, l’extraction de la biotine permet la ligature de l’adaptateur et l’amplification de la bibliothèque par PCR (6). Abréviations : FA = formaldéhyde; DSG = glutarate de disuccinimidyl; B = Biotine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Étapes critiques pour la manipulation des cellules
Bien qu’il soit possible d’utiliser un nombre inférieur de cellules d’entrée, ce protocole a été optimisé pour ~5 × 106 cellules par voie de séquençage (~400 M de lectures) pour assurer une complexité appropriée après un séquençage profond. Il est préférable de compter les cellules avant la fixation. Pour la génération de bibliothèques ultraprofondes, nous multiplions généralement le nombre de voies (et de cellules) jusqu’à ce que la profondeur de lecture souhaitée soit atteinte. Pour une fixation optimale, le milieu contenant du sérum doit être remplacé par du PBS avant la fixation par FA, et des solutions fixatrices doivent être ajoutées immédiatement et sans gradients de concentration15,22. Pour la récolte cellulaire, le grattage est préféré à la trypsinisation, car le passage d’une forme plus plate à une forme sphérique après trypsinisation pourrait affecter la conformation nucléaire. Après l’ajout de DSG, les granulés cellulaires lâches et grumeleux sont facilement perdus. Soyez prudent lorsque vous manipulez des cellules à ce stade et ajoutez jusqu’à 0,05% de BSA pour diminuer l’agglutination.
Modifications de la méthode
Ce protocole a été développé à partir de cellules humaines17. Pourtant, sur la base de l’expérience avec la capture de conformation chromosomique, ce protocole devrait fonctionner pour la plupart des cellules eucaryotes. Pour une entrée significativement plus faible (~1 × 106 cellules), nous conseillons d’utiliser la moitié des volumes pour les procédures de lyse et de capture de conformation [étapes 2.1-2.4]. Cela permettrait également d’isoler l’ADN [étape 2.5] dans une centrifugeuse de table avec des tubes de 1,7 mL, ce qui pourrait améliorer la granulation pour de faibles concentrations d’ADN. La quantification de l’ADN (étape 2.6.6) indiquera comment procéder. Pour de faibles quantités d’ADN isolé (1-5 μg), nous suggérons de sauter la sélection de la taille (étape 3.3) et de procéder à l’élimination de la biotine après avoir réduit le volume de 130 μL à ~45 μL avec une UFC.
Ce protocole a été développé spécifiquement pour garantir des données de haute qualité après réticulation ultérieure avec FA et DSG et digestion avec DpnII et DdeI. Cependant, d’autres stratégies de réticulation telles que l’AF suivie de l’EGS (éthylène glycol bis(succinimidyl succinate)), qui est également utilisé dans ChIP-seq23 et-PET24, pourraient fonctionner tout aussi bien17. De même, différentes combinaisons d’enzymes, telles que DpnII et HinfI18 ou MboI, MseI et NlaIII19 peuvent être utilisées pour la digestion. Lors de l’adaptation des combinaisons d’enzymes, assurez-vous d’utiliser des nucléotides biotinylés qui peuvent remplir les surplombs spécifiques de 5′ et utilisez les tampons les plus optimaux pour chaque cocktail. DpnII est livré avec son propre tampon et le fabricant d’enzymes recommande un tampon spécifique pour la digestion DdeI. Pourtant, pour la double digestion avec DpnII et DdeI dans ce protocole, Restriction Buffer est recommandé car il est évalué à 100% d’activité pour les deux enzymes.
Résolution des problèmes liés à la capture de conformation
Les trois étapes clés de la capture de la conformation chromosomique: la réticulation, la digestion et la ligature ont toutes été effectuées avant que les résultats puissent être visualisés sur gel. Pour déterminer la qualité de chacune de ces trois étapes et discerner où des problèmes auraient pu survenir, des aliquotes avant (IC) et après digestion (DC) sont prélevées et chargées sur le gel avec l’échantillon de Hi-C ligaturé (Figure 2). Ce gel est utilisé pour déterminer la qualité de l’échantillon Hi-C et s’il vaut la peine de poursuivre le protocole. Sans l’IC et le CD, il est difficile d’identifier les étapes sous-optimales potentielles. Il convient de noter que la ligature sous-optimale peut être due à un problème de ligature elle-même, au remplissage ou à un problème de réticulation. Pour résoudre les problèmes de réticulation, veillez à ne pas utiliser plus de 1 × 10 à7 cellules par bibliothèque et commencez par de nouveaux réactifs de réticulation et des cellules propres (c’est-à-dire rincées avec du PBS). Pour la ligature, assurez-vous que les cellules et le mélange de ligature sont conservés sur la glace. Ajouter l’ADN ligase T4 juste avant l’incubation de 4 h à 16 °C et bien mélanger.
Dépannage de la préparation de la bibliothèque
Si plus de 10 cycles de PCR sont nécessaires ou si aucun produit PCR ne peut être vu sur le gel après titrage PCR (Figure 4), il existe quelques options pour enregistrer l’échantillon Hi-C. En revenant au titrage PCR, la première option consiste à réessayer la PCR. S’il n’y a toujours pas assez de produit, il est possible de tenter une autre série de ligature de queue A et d’adaptateur (étape 3.6) après avoir lavé les billes deux fois avec 1x tampon TLE. Après cette ligature supplémentaire de la queue A et de l’adaptateur, on peut procéder au titrage PCR comme précédemment. S’il n’y a toujours pas de produit, la dernière option consiste à résoniser la fraction 0,8x de l’étape 3.3 et à partir de là.
Limitations et avantages de Hi-C3.0
Il est important de réaliser que Hi-C est une méthode basée sur la population qui capture la fréquence moyenne des interactions entre les paires de loci dans la population cellulaire. Certaines analyses informatiques sont conçues pour démêler les combinaisons de conformations d’une population25, mais en principe, Hi-C est aveugle aux différences entre les cellules. Bien qu’il soit possible d’effectuer une Hi-C monocellulaire26,27 et que des inférences informatiques puissent être faites28, la Hi-C monocellulaire ne convient pas pour obtenir des informations 3C à ultrahaute résolution. Une limitation supplémentaire de Hi-C est qu’il ne détecte que les interactions par paires. Pour détecter les interactions multicontacts, on peut soit utiliser des couteaux fréquents combinés avec un séquençage à lecture courte (Illumina)16 ou effectuer des multicontacts 3C29 ou 4C30, en utilisant le séquençage à lecture longue des plateformes PacBio ou Oxford Nanopore. Des dérivés Hi-C pour détecter spécifiquement les contacts entre et le long des chromatides sœurs ont également été développés31,32.
Bien que Hi-C19 et Micro-C33 puissent être utilisés pour générer des cartes de contact à des résolutions inférieures à la kilobase, les deux nécessitent une grande quantité de lectures de séquençage, ce qui peut devenir une entreprise coûteuse. Pour obtenir une résolution similaire ou même supérieure sans les coûts, l’enrichissement pour des régions génomiques spécifiques (capture-C34) ou des interactions protéiques spécifiques (-PET 35, PLAC-seq 36, Hi-ChIP37) peuvent être appliqués. La force et l’inconvénient de ces applications d’enrichissement sont que seul un nombre limité d’interactions sont échantillonnées. Avec de tels enrichissements, l’aspect global de Hi-C (et l’option de normalisation globale) est perdu.
Importance et applications potentielles de Hi-C3.0
Ce protocole a été conçu pour permettre une 3C ultraprofonde haute résolution tout en détectant simultanément les caractéristiques de pliage à grande échelle telles que les TAD et les compartiments17 (Figure 6). Ce protocole commence avec 5 × 106 cellules par tube pour chaque bibliothèque Hi-C, ce qui devrait être plus que suffisant pour séquencer une ou deux voies sur une cellule d’écoulement pour obtenir jusqu’à 1 milliard de lectures d’extrémité appariée. Pour le séquençage ultraprofond, plusieurs tubes de 5 × 106 cellules doivent être préparés, en fonction du nombre de lectures cartographiées et de doublons PCR. À la résolution la plus élevée (<1 kb), les interactions en boucle se trouvent principalement entre les sites CTCF, mais les interactions promoteur-amplificateur peuvent également être détectées. Les lecteurs peuvent consulter Akgol Oksuz et coll.17 pour une description détaillée de l’analyse des données.
The authors have nothing to disclose.
Nous tenons à remercier Denis Lafontaine pour le développement du protocole et Sergey Venev pour l’assistance bioinformatique. Ce travail a été soutenu par une subvention du National Institutes of Health Common Fund 4D Nucleome Program à J.D. (U54-DK107980, UM1-HG011536). J.D. est un chercheur du Howard Hughes Medical Institute.
Cet article est soumis à la politique de libre accès aux publications de HHMI. Les chefs de laboratoire HHMI ont déjà accordé une licence CC BY 4.0 non exclusive au public et une licence sous-licenciable à HHMI dans leurs articles de recherche. Conformément à ces licences, le manuscrit accepté par l’auteur de cet article peut être mis gratuitement à disposition sous une licence CC BY 4.0 dès sa publication.
1 kb Ladder | New England Biolabs | N3232L | |
Agarose | Invitrogen | 16500100 | |
Agencourt AMPure XP magnetic beads , 60 mL | Beckman Coulter | A63881 | |
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit (CFU) | EMD Millipore | UFC500396 | |
Annealing Buffer (5x) | See recipe in supplemental materials | ||
ATP 10 mM | ThermoFisher | R0441 | |
Avanti J-25i High Speed Refrigerated ultra-centrifuge | Beckman Coulter | ||
beckman ultracentrifuge tube 35 mL | Beckman Coulter | 357002 | |
Binding Buffer (2x) | See recipe in supplemental materials | ||
biotin-14-dATP 0.4 mM | Invitrogen | 19524-016 | |
BSA 10 mg/mL | New England Biolabs | B9000S | dilute from 20 mg/mL |
Cell scraper | Falcon | 353089 | |
Cell scraper | Corning | 3008 | |
Conical polypropylene tubes 50 mL | Denville | C1062-P | |
Conical tube 15 mL | Denville | C1017-P | |
Covaris micro tube AFA fiber with snap-cap 130 µL | Covaris | 520045/520077 | |
Covaris Sonicator | Covaris | E220/E220evolution/M220 | |
Culture flask 175 cm2 | Falcon | 353112 | |
Culture plates 150 mm x 25 mm | Corning | 430599 | |
dATP 1 mM | Invitrogen | 56172 | |
dATP 10 mM | Invitrogen | 56172 | |
dCTP 10 mM | Invitrogen | 56173 | |
DdeI | New England Biolabs | R0175L | |
dGTP 10 mM | Invitrogen | 56174 | |
DMSO | Sigma | D2650-5x10ML | |
dNTP mix 25 mM | Invitrogen | 10297117 | |
Dounce homogenizer | DWK Life Sciences | 8853010002/8853030002 | |
DPBS | Gibco | 14190-144 | |
DpnII | New England Biolabs | R0543M | |
DSG | ThermoScientific | 20593 | |
dTTP 10 mM | Invitrogen | 56175 | |
Ethanol 70% | Fisher | A409-4 | Diluted from 100% |
Ethidium Bromide | Fisher | BP1302-10 | |
Formaldehyde (37%) | Fisher | BP531-500 | |
Gel loading dye (6x ) | New England Biolabs | B7024S | |
Glycine in ultrapure water 2.5 M | Sigma | G8898-1KG | |
HBSS | Gibco | 14025-092 | |
Igepal CA-630 detergent | MP Biomedicals | 198596 | |
Klenow DNA polymerase 5 U/µL | New England Biolabs | M0210L | |
Klenow Fragment 3–>5’ exo-, 5 U/µL | New England Biolabs | M0212L | |
ligation buffer (10x) | New England Biolabs | B7203S | |
Liquid nitrogen | |||
LoBind microcentrifuge tube 1.7 mL | Eppendorf | 22431021 | |
Low Molecular Weight DNA Ladder | New England Biolabs | N3233L | |
Lysis buffer | See recipe in supplemental materials | ||
Magnetic Particle separator | ThermoFisher | 12321D | |
Microfuge tubes 1.7 mL | Axygen | MCT-175-C | |
MyOne Streptavidin C1 beads | Invitrogen | 65001 | |
NEBuffer 2.1 (10x) | New England Biolabs | B7002S | |
NEBuffer 3.1 (10x) | New England Biolabs | B7203S | |
PBS | Gibco | 70013-032 | |
PCR (strip) tubes | Biorad | TBS0201/ TCS0803 | |
PCR thermocycler | Biorad | T100 | |
Pfu Ultra II Buffer (10x) | Agilent | Comes with Pfu Ultra | |
PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase | Agilent | 600674 | |
Phase lock tube 15 mL | Qiagen | 129065 | |
Phase lock tubes 2 mL | Qiagen | 129056 | |
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Invitrogen | 15593-049 | |
Protease inhibitor cocktail | ThermoFisher | 78440 | |
Proteinase K in ultrapure water 10 mg/mL | Invitrogen | 25530-031 | |
Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
RNase A, DNase and protease-free 10 mg/mL | Thermo Scientific | EN0531 | |
Rotator | Argos technologies | EW-04397-40 or rocking platform | |
SDS 1% | Fisher | BP13111 | |
Sodium acetate pH = 5.2, 3 M | Sigma | ||
Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System | Biorad | 1704401 | |
T4 DNA ligase 1 U/µL | Invitrogen | 100004817 | |
T4 DNA polymerase | New England Biolabs | M0203L | |
T4 DNA polymerase | New England Biolabs | M0203L | |
T4 DNA polymerase 3 U/µL | New England Biolabs | M0203L | |
T4 ligation buffer (5x) | Invitrogen | Y90001 | |
T4 polynucleotide kinase 10 U/µL | New England Biolabs | M0201L | |
Tabletop centrifuge | Eppendorf | 5425 | |
TBE buffer | See recipe in supplemental materials | ||
Tris Low EDTA Buffer (TLE) | See recipe in supplemental materials | ||
Triton X-100 (10%) | Sigma | 93443 | |
Truseq adapter oligos | Integrated DNA Technologies (IDT)) | https://www.idtdna.com/site/order/oligoentry | 250 nmole and HPLC purified |
Tween 20 detergent | Fisher | 9005-64-5 | |
Tween Wash Buffer | See recipe in supplemental materials | ||
Vortex | Scientific Industries | (G560)SI-0236 |