Hi-C 3.0은 포름알데히드 및 디숙신이미딜글루타레이트 가교결합제를 DpnII 및 DdeI 제한 효소의 칵테일과 결합하여 신호 대 잡음비와 염색질 상호 작용 감지의 분해능을 높이는 개선된 Hi-C 프로토콜입니다.
염색체 형태 캡처(3C)는 3차원 염색질 상호 작용을 감지하는 데 사용됩니다. 일반적으로 포름알데히드(FA)와의 화학적 가교는 염색질 상호 작용을 수정하는 데 사용됩니다. 그런 다음 제한 효소를 사용한 염색질 분해와 단편 말단의 후속 재생은 3차원(3D) 근접성을 고유한 결찰 산물로 변환합니다. 마지막으로, 가교결합의 역전, 단백질 제거 및 DNA 분리 후, DNA를 전단하고 고처리량 시퀀싱을 위해 준비합니다. 유전자좌 쌍의 근접 결찰 빈도는 세포 집단의 3 차원 공간에서의 공동 국소화 빈도의 척도입니다.
시퀀싱된 Hi-C 라이브러리는 모든 유전자좌 쌍 간의 상호 작용 빈도에 대한 게놈 전체 정보를 제공합니다. Hi-C의 분해능과 정밀도는 염색질 접촉과 염색질의 빈번하고 균일한 단편화를 유지하는 효율적인 가교에 의존합니다. 이 논문에서는 두 개의 가교제(포름알데히드[FA] 및 디숙신이미딜 글루타레이트[DSG])를 결합한 후 두 가지 제한 효소(DpnII 및 DdeI)를 사용하여 더 미세하게 분해하여 가교 효율성을 높이는 개선된 현장 Hi-C 프로토콜인 Hi-C 3.0에 대해 설명합니다. Hi-C 3.0은 루프 및 토폴로지 연관 도메인(TAD)과 같은 더 작은 규모에서 게놈 접힘 특징과 구획과 같은 더 큰 핵 전체 규모의 특징을 정확하게 정량화하기 위한 단일 프로토콜입니다.
염색체 형태 포착은 2002 년부터 사용되었습니다1. 기본적으로 모든 형태 포착 변형은 3D 염색질 조직을 보존하기 위해 DNA-단백질 및 단백질-단백질 상호 작용의 고정에 의존합니다. 그 다음에는 일반적으로 제한 소화에 의한 DNA 단편화가 뒤따르고, 마지막으로 주변 DNA의 종교화가 말단에 이르러 공간적으로 근위 유전자좌를 고유한 공유 DNA 서열로 변환합니다. 초기 3C 프로토콜은 PCR을 사용하여 특정 “일대일” 상호 작용을 샘플링했습니다. 후속 4C 분석은 “일대일” 상호작용2의 검출을 허용한 반면, 5C는 “다대다” 상호작용3을 검출하였다. 염색체 형태 캡처는 차세대 고처리량 시퀀싱(NGS)을 구현한 후 완전한 결실을 맺었으며, 이를 통해 게놈 전체의 Hi-C4 및 3C-seq5, TCC6 및 Micro-C 7,8과 같은 유사한 기술을 사용하여 “올-투-올” 게놈 상호 작용을 검출할 수 있었습니다(Denker 및 De Laat9의 검토 참조).
Hi-C에서 비오틴화 뉴클레오티드는 소화 후 및 결찰 전에 5′ 돌출부를 표시하는 데 사용됩니다(그림 1). 이를 통해 스트렙타비딘 코팅 비드를 사용하여 적절하게 소화되고 재생산된 단편을 선택할 수 있어 GCC10과 차별화됩니다. Hi-C 프로토콜에 대한 중요한 업데이트는 가짜 결찰 생성물을 줄이기 위해 손상되지 않은 핵(즉, 제자리)에서 소화 및 알코올화를 수행한 Rao et al.11에 의해 구현되었습니다. 또한 HindIII 분해를 MboI (또는 DpnII) 분해로 대체하면 단편 크기가 감소하고 Hi-C의 분해능 잠재력이 증가했습니다. 이러한 증가는 상대적으로 작은 스케일의 구조의 검출 및 작은 시스-요소 사이의 DNA 루프, 예를 들어, 루프 압출(11,12)에 의해 생성된 CTCF-결합 부위 사이의 루프와 같은 접촉점의 보다 정확한 게놈 국소화를 가능하게 하였다. 그러나 이러한 잠재력에는 대가가 따릅니다. 첫째, 해상도가 2배 증가하려면 시퀀싱 읽기13이 4배(22) 증가해야 합니다. 둘째, 작은 단편 크기는 소화되지 않은 이웃 단편을 소화되고 종교화된 단편(14)으로 착각할 가능성을 증가시킨다. 언급 한 바와 같이, Hi-C에서, 소화 된 단편과 종교화 된 단편은 결찰 접합부에 비오틴이 존재함으로써 소화되지 않은 단편과 다르다. 그러나, 결찰 접합부만 아래로 당겨지도록 하기 위해 의무가 없는 말단에서 적절한 비오틴 제거가 필요하다 14,15.
NGS의 비용이 감소함에 따라 염색체 접힘을 더 자세히 연구하는 것이 가능해졌습니다. DNA 단편의 크기를 감소시키고 그에 따라 분해능을 증가시키기 위해, Hi-C 프로토콜은 더 빈번하게 절단 제한 효소 16을 사용하거나 제한 효소17, 18,19의 조합을 사용하도록 적응될 수 있다. 대안적으로, 마이크로-C 중의 MNase 7,8 및 DNase Hi-C20 중의 DNase는 최적의 소화를 달성하기 위해 적정될 수 있다.
3C 방법의 기초에 대한 최근의 체계적인 평가는 모든 길이 척도에서 염색체 접힘 특징의 검출이 1 % FA와 3mM DSG17을 사용한 순차적 가교로 크게 향상되었음을 보여주었습니다. 또한 HindIII 분해가 가능한 Hi-C는 구획과 같은 대규모 접힘 특징을 감지하는 데 가장 적합한 옵션이었으며 Micro-C는 DNA 루프와 같은 소규모 접힘 특징을 감지하는 데 탁월했습니다. 이러한 결과는 FA 및 DSG 가교결합제의 조합과 DpnII 및 DdeI 엔도뉴클레아제21을 사용한 이중 분해를 사용하는 단일 고해상도 “Hi-C 3.0” 전략의 개발로 이어졌습니다. Hi-C 3.0은 모든 길이 스케일에서 접힘 형상을 정확하게 감지하기 때문에 일반적인 사용에 효과적인 전략을 제공합니다17. Hi-C 3.0 프로토콜의 실험 부분은 여기에 자세히 설명되어 있으며 시퀀싱 후 예상 할 수있는 일반적인 결과가 표시됩니다.
그림 1: 6단계의 Hi-C 절차. 셀은 먼저 FA로 고정 된 다음 DSG (1)로 고정됩니다. 그런 다음 용해는 DdeI 및 DpnII로 이중 소화에 선행합니다 (2). 비오틴은 오버행 필인에 의해 첨가되고 근위 무딘 끝은 DNA 정제 (4) 전에 결찰됩니다 (3). 비오틴은 초음파 처리 및 크기 선택 전에 의무화되지 않은 끝에서 제거됩니다 (5). 마지막으로, 비오틴의 풀다운은 PCR에 의한 어댑터 결찰 및 라이브러리 증폭을 허용합니다(6). 약어 : FA = 포름 알데히드; DSG = 디숙신이미딜글루타레이트; B = 비오틴. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
세포 취급을 위한 중요한 단계
더 적은 수의 입력 셀을 사용할 수 있지만 이 프로토콜은 딥 시퀀싱 후 적절한 복잡성을 보장하기 위해 시퀀싱 레인당 ~5 × 106개의 셀(~400M 읽기)에 최적화되었습니다. 세포는 고정 전에 가장 잘 계산됩니다. 울트라딥 라이브러리 생성을 위해 일반적으로 원하는 판독 깊이에 도달할 때까지 레인(및 셀)의 수를 곱합니다. 최적의 고정을 위해, FA 고정 전에 혈청 함유 배지를 PBS로 교체해야하며, 고정 용액은 농도 구배15,22없이 즉시 첨가되어야한다. 세포 수확의 경우, 트립신 화 후 더 평평한 모양에서 구형으로의 전환이 핵 형태에 영향을 미칠 수 있기 때문에 트립신 화보다 스크래핑이 선호됩니다. DSG를 첨가 한 후에는 느슨하고 덩어리진 세포 펠릿이 쉽게 손실됩니다. 이 단계에서 셀을 취급할 때 주의하고 응집을 줄이기 위해 최대 0.05% BSA를 추가하십시오.
방법 수정
이 프로토콜은 인간 세포17을 사용하여 개발되었습니다. 그러나 염색체 형태 포획 경험에 비추어 볼 때 이 프로토콜은 대부분의 진핵 세포에서 작동해야 합니다. 상당히 낮은 입력(~1 × 106 셀)의 경우 용해 및 형태 캡처 절차[단계 2.1-2.4]에 볼륨의 절반을 사용하는 것이 좋습니다. 이것은 또한 1.7mL 튜브가 있는 탁상용 원심분리기에서 DNA 분리[단계 2.5]를 수행할 수 있게 하여 낮은 DNA 농도에 대한 펠릿화를 개선할 수 있습니다. DNA의 정량화 (2.6.6 단계)는 진행 방법을 나타냅니다. 소량의 분리 된 DNA (1-5 μg)의 경우 크기 선택 (3.3 단계)을 건너 뛰고 CFU로 부피를 130 μL에서 ~ 45 μL로 줄인 후 비오틴 제거를 진행하는 것이 좋습니다.
이 프로토콜은 FA 및 DSG와의 후속 가교 및 DpnII 및 DdeI와의 분해 후 고품질 데이터를 보장하기 위해 특별히 개발되었습니다. 그러나 FA에 이어 EGS (에틸렌 글리콜 비스 (숙신이 미딜 숙시 네이트))와 같은 대안적인 가교 전략은 ChIP-seq23 및 ChIA-PET24에서도 사용되며17도 똑같이 잘 작동 할 수 있습니다. 유사하게, 상이한 효소 조합, 예컨대 DpnII 및 HinfI18 또는 MboI, MseI, 및 NlaIII19가 소화에 사용될 수 있다. 효소 조합을 조정할 때 특정 5′ 오버행을 채울 수 있는 비오티닐화 뉴클레오티드를 사용하고 각 칵테일에 가장 최적의 완충액을 사용해야 합니다. DpnII는 자체 완충액과 함께 제공되며 효소 제조업체는 DdeI 분해를 위한 특정 완충액을 권장합니다. 그러나 이 프로토콜에서 DpnII 및 DdeI를 사용한 이중 분해의 경우 제한 버퍼는 두 효소 모두에 대해 100% 활성으로 평가되기 때문에 권장됩니다.
형태 캡처 문제 해결
염색체 형태 포착의 세 가지 주요 단계인 가교, 소화 및 종교화는 결과를 젤에 시각화하기 전에 모두 수행되었습니다. 이 세 단계 각각의 품질을 결정하고 문제가 발생할 수 있는 부분을 식별하기 위해 분해 전후(CI) 분취량을 가져와 결찰된 Hi-C 샘플과 함께 젤에 로드합니다(그림 2). 이 젤은 Hi-C 샘플의 품질과 프로토콜을 계속할 가치가 있는지 여부를 결정하는 데 사용됩니다. CI 및 DC가 없으면 잠재적인 차선의 단계를 정확히 찾아내기가 어렵습니다. 차선의 결찰은 결찰 자체의 문제, 채우기 또는 가교 문제로 인한 것일 수 있습니다. 가교 문제를 해결하려면 라이브러리당 1개 × 10개 7개 이상의 세포를 사용하지 말고 새로운 가교 시약과 깨끗한 세포(즉, PBS로 헹궈짐)로 시작하십시오. 결찰을 위해 세포와 결찰 혼합물이 얼음 위에 보관되어 있는지 확인하십시오. 16°C에서 4시간 인큐베이션 직전에 T4 DNA 리가아제를 첨가하고 잘 혼합한다.
라이브러리 준비 문제 해결
10회 이상의 PCR 주기가 필요하거나 PCR 적정 후 겔에서 PCR 산물을 볼 수 없는 경우(그림 4), Hi-C 샘플을 저장할 수 있는 몇 가지 옵션이 있습니다. PCR 적정에서 다시 작업하면 첫 번째 옵션은 PCR을 다시 시도하는 것입니다. 여전히 생성물이 충분하지 않은 경우, 비드를 1x TLE 완충액으로 2회 세척한 후 A-테일링 및 어댑터 라이게이션(단계 3.6)의 또 다른 라운드를 시도할 수 있다. 이 추가 A-테일링 및 어댑터 결찰 후 이전과 같이 PCR 적정을 진행할 수 있습니다. 여전히 제품이 없으면 마지막 옵션은 3.3 단계에서 0.8x 분수를 다시 음압하고 거기에서 진행하는 것입니다.
Hi-C3.0의 한계와 장점
Hi-C는 세포 집단에서 유전자좌 쌍 간의 상호 작용의 평균 빈도를 캡처하는 집단 기반 방법이라는 것을 인식하는 것이 중요합니다. 일부 전산 분석은 집단25에서 형태의 조합을 풀도록 설계되었지만 원칙적으로 Hi-C는 세포 간의 차이를 인식하지 못합니다. 단일 셀 Hi-C(26,27)를 수행할 수 있고 계산 추론(28)을 수행할 수 있지만, 단일 셀 Hi-C는 초고해상도 3C 정보를 얻기에 적합하지 않습니다. Hi-C의 추가 제한 사항은 쌍별 상호 작용만 감지한다는 것입니다. 다중 접촉 상호 작용을 감지하기 위해 짧은 읽기 시퀀싱(Illumina)16과 결합된 빈번한 커터를 사용하거나 PacBio 또는 Oxford Nanopore 플랫폼의 긴 읽기 시퀀싱을 사용하여 다중 접촉 3C29 또는 4C30을 수행할 수 있습니다. 자매 염색분체 사이의 접촉을 특이적으로 감지하기 위한 Hi-C 유도체도 개발되었습니다.31,32.
Hi-C19 및 Micro-C33을 사용하여 서브킬로베이스 해상도에서 접촉 맵을 생성할 수 있지만 둘 다 많은 양의 시퀀싱 읽기가 필요하며 이는 비용이 많이 드는 작업이 될 수 있습니다. 비용 없이 유사하거나 더 높은 분해능을 얻기 위해 특정 게놈 영역(캡처-C 34) 또는 특정 단백질 상호 작용(ChiA-PET 35, PLAC-seq36, Hi-ChIP37)에 대한 농축을 적용할 수 있습니다. 이러한 보강 응용 프로그램의 강점과 단점은 제한된 수의 상호 작용만 샘플링된다는 것입니다. 이러한 보강으로 Hi-C의 글로벌 측면 (및 글로벌 정규화 옵션)이 손실됩니다.
Hi-C3.0의 중요성과 잠재적 응용 분야
이 프로토콜은 고분해능, 초심층 3C를 가능하게 하는 동시에 TAD 및 구획(17 )과 같은 대규모 폴딩 기능을 감지하도록 설계되었습니다(그림 6). 이 프로토콜은 각 Hi-C 라이브러리에 대해 튜브당 5개 × 10개6 개의 셀로 시작하며, 이는 최대 10억 개의 쌍 최종 판독을 얻기 위해 플로우 셀에서 하나 또는 두 개의 레인을 시퀀싱하기에 충분한 재료여야 합니다. 초심층 시퀀싱의 경우 매핑된 판독 및 PCR 중복 수에 따라 5 × 106 세포의 다중 튜브를 준비해야 합니다. 최고 해상도(<1kb)에서 루핑 상호작용은 대부분 CTCF 부위 사이에서 발견되지만 프로모터-인핸서 상호작용도 검출할 수 있습니다. 독자는 데이터 분석에 대한 자세한 설명을 위해 Akgol Oksuz et al.17 을 참조할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
프로토콜 개발을 위해 Denis Lafontaine과 생물 정보학 지원을 위해 Sergey Venev에게 감사드립니다. 이 연구는 국립 보건원 공통 기금 4D 뉴클레옴 프로그램에서 JD(U54-DK107980, UM1-HG011536)로의 보조금으로 지원되었습니다. JD는 Howard Hughes Medical Institute의 연구원입니다.
이 문서는 HHMI의 출판물에 대한 오픈 액세스 정책의 적용을 받습니다. HHMI 연구소장은 이전에 대중에게 비독점적 CC BY 4.0 라이선스를 부여하고 연구 논문에서 HHMI에 대한 재라이선스 라이선스를 부여했습니다. 이러한 라이선스에 따라 저자가 수락한 이 논문의 원고는 출판 즉시 CC BY 4.0 라이선스에 따라 무료로 사용할 수 있습니다.
1 kb Ladder | New England Biolabs | N3232L | |
Agarose | Invitrogen | 16500100 | |
Agencourt AMPure XP magnetic beads , 60 mL | Beckman Coulter | A63881 | |
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit (CFU) | EMD Millipore | UFC500396 | |
Annealing Buffer (5x) | See recipe in supplemental materials | ||
ATP 10 mM | ThermoFisher | R0441 | |
Avanti J-25i High Speed Refrigerated ultra-centrifuge | Beckman Coulter | ||
beckman ultracentrifuge tube 35 mL | Beckman Coulter | 357002 | |
Binding Buffer (2x) | See recipe in supplemental materials | ||
biotin-14-dATP 0.4 mM | Invitrogen | 19524-016 | |
BSA 10 mg/mL | New England Biolabs | B9000S | dilute from 20 mg/mL |
Cell scraper | Falcon | 353089 | |
Cell scraper | Corning | 3008 | |
Conical polypropylene tubes 50 mL | Denville | C1062-P | |
Conical tube 15 mL | Denville | C1017-P | |
Covaris micro tube AFA fiber with snap-cap 130 µL | Covaris | 520045/520077 | |
Covaris Sonicator | Covaris | E220/E220evolution/M220 | |
Culture flask 175 cm2 | Falcon | 353112 | |
Culture plates 150 mm x 25 mm | Corning | 430599 | |
dATP 1 mM | Invitrogen | 56172 | |
dATP 10 mM | Invitrogen | 56172 | |
dCTP 10 mM | Invitrogen | 56173 | |
DdeI | New England Biolabs | R0175L | |
dGTP 10 mM | Invitrogen | 56174 | |
DMSO | Sigma | D2650-5x10ML | |
dNTP mix 25 mM | Invitrogen | 10297117 | |
Dounce homogenizer | DWK Life Sciences | 8853010002/8853030002 | |
DPBS | Gibco | 14190-144 | |
DpnII | New England Biolabs | R0543M | |
DSG | ThermoScientific | 20593 | |
dTTP 10 mM | Invitrogen | 56175 | |
Ethanol 70% | Fisher | A409-4 | Diluted from 100% |
Ethidium Bromide | Fisher | BP1302-10 | |
Formaldehyde (37%) | Fisher | BP531-500 | |
Gel loading dye (6x ) | New England Biolabs | B7024S | |
Glycine in ultrapure water 2.5 M | Sigma | G8898-1KG | |
HBSS | Gibco | 14025-092 | |
Igepal CA-630 detergent | MP Biomedicals | 198596 | |
Klenow DNA polymerase 5 U/µL | New England Biolabs | M0210L | |
Klenow Fragment 3–>5’ exo-, 5 U/µL | New England Biolabs | M0212L | |
ligation buffer (10x) | New England Biolabs | B7203S | |
Liquid nitrogen | |||
LoBind microcentrifuge tube 1.7 mL | Eppendorf | 22431021 | |
Low Molecular Weight DNA Ladder | New England Biolabs | N3233L | |
Lysis buffer | See recipe in supplemental materials | ||
Magnetic Particle separator | ThermoFisher | 12321D | |
Microfuge tubes 1.7 mL | Axygen | MCT-175-C | |
MyOne Streptavidin C1 beads | Invitrogen | 65001 | |
NEBuffer 2.1 (10x) | New England Biolabs | B7002S | |
NEBuffer 3.1 (10x) | New England Biolabs | B7203S | |
PBS | Gibco | 70013-032 | |
PCR (strip) tubes | Biorad | TBS0201/ TCS0803 | |
PCR thermocycler | Biorad | T100 | |
Pfu Ultra II Buffer (10x) | Agilent | Comes with Pfu Ultra | |
PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase | Agilent | 600674 | |
Phase lock tube 15 mL | Qiagen | 129065 | |
Phase lock tubes 2 mL | Qiagen | 129056 | |
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Invitrogen | 15593-049 | |
Protease inhibitor cocktail | ThermoFisher | 78440 | |
Proteinase K in ultrapure water 10 mg/mL | Invitrogen | 25530-031 | |
Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
RNase A, DNase and protease-free 10 mg/mL | Thermo Scientific | EN0531 | |
Rotator | Argos technologies | EW-04397-40 or rocking platform | |
SDS 1% | Fisher | BP13111 | |
Sodium acetate pH = 5.2, 3 M | Sigma | ||
Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System | Biorad | 1704401 | |
T4 DNA ligase 1 U/µL | Invitrogen | 100004817 | |
T4 DNA polymerase | New England Biolabs | M0203L | |
T4 DNA polymerase | New England Biolabs | M0203L | |
T4 DNA polymerase 3 U/µL | New England Biolabs | M0203L | |
T4 ligation buffer (5x) | Invitrogen | Y90001 | |
T4 polynucleotide kinase 10 U/µL | New England Biolabs | M0201L | |
Tabletop centrifuge | Eppendorf | 5425 | |
TBE buffer | See recipe in supplemental materials | ||
Tris Low EDTA Buffer (TLE) | See recipe in supplemental materials | ||
Triton X-100 (10%) | Sigma | 93443 | |
Truseq adapter oligos | Integrated DNA Technologies (IDT)) | https://www.idtdna.com/site/order/oligoentry | 250 nmole and HPLC purified |
Tween 20 detergent | Fisher | 9005-64-5 | |
Tween Wash Buffer | See recipe in supplemental materials | ||
Vortex | Scientific Industries | (G560)SI-0236 |