해부학적으로 특이적인 단일 세포 유전자 발현 방법을 사용한 중독 행동의 반보상 동인 조사
Summary
레이저 포획 미세 해부와 미세 유체 RT-qPCR의 조합은 단일 뉴런 및 아교 세포에서 전사체를 측정 할 때 해부학 적 및 생물 공학적 특이성을 제공합니다. 정신 질환에 대한 시스템의 생물학적 접근 방식으로 창의적인 방법을 적용하면 중독에 대한 신경 염증 보상 가설과 같은 이해와 치료의 돌파구로 이어질 수 있습니다.
Abstract
중독 행동의 증가율은 정신 건강 연구자와 임상의 모두가 안티 보상과 회복을 이해하도록 동기를 부여했습니다. 보상과 시작에서 벗어나는 이러한 전환은 중독을 조사하는 데 적용되는 방법의 확장과 함께 새로운 관점, 패러다임 및 가설을 필요로합니다. 여기에서는 레이저 포획 미세 해부(LCM)와 고처리량 미세유체 역전사 정량적 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR)을 결합한 안티보상을 조사하기 위한 시스템 생물학 접근 방식을 제공합니다. 유전자 발현 네트워크 역학을 측정하고 알코올 및 오피오이드 금단에서 신경 내장 조절 장애의 주요 동인인 신경 염증을 확인했습니다. 이러한 기술의 조합은 높은 처리량 감도 및 특정 유전자 발현 측정과 함께 단일 세포 분해능에서 해부학적 및 표현형 특이성을 제공하여 가설 생성 데이터 세트와 새로운 통찰력 및 치료 기회를 생성하는 기계론적 가능성을 모두 제공합니다.
Introduction
중독은 선진국에서 여전히 증가하는 도전으로 남아 있습니다 1,2. 주요 과학 및 임상 발전에도 불구하고 중독률은 계속 증가하는 반면 기존 치료법의 효능은 기껏해야 안정적으로 유지됩니다 3,4,5. 그러나 생명 공학과 과학적 접근의 발전으로 물질 의존의 병태 생리학을 추가로 조사하기위한 새로운 방법과 가설이 생겨났습니다 6,7,8. 실제로, 최근의 발전은 새로운 개념과 치료 패러다임이 사회적, 경제적, 정치적 결과를 가져 오는 돌파구로 이어질 수 있음을 시사합니다 9,10,11,12.
우리는 알코올 및 오피오이드 의존13,14,15,16의 중단에 대한 보상에 대한 반보상을 조사했습니다. 방법은이 패러다임17,18의 핵심입니다. 레이저 포획 미세 해부(LCM)는 해부학적 특이성이 높은 단일 세포를 선택할 수 있습니다. 이 기능은 신경교와 뉴런 모두 동일한 동물13,14,15,16,19의 동일한 뉴런 하핵에서 수집 및 분석될 수 있기 때문에 신경염증 항보상 가설에 필수적입니다. 그런 다음 선택된 세포의 전사체의 관련 부분을 고처리량 미세유체 역전사 정량적 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR)으로 측정하여 기능적 네트워크(20,21)에 대한 통찰력을 제공하는 전산 분석을 위한 고차원 데이터 세트를 제공할 수 있습니다.
특정 뇌핵의 뉴런과 아교세포에서 전사체의 하위 집합을 측정하면 샘플 수와 측정된 유전자 모두에서 견고하고 민감하고 특이적인 데이터 세트가 생성됩니다. 이러한 도구는 주로 성상 세포와 미세 아교 세포와 같은 아교 세포가 지난 10 년 동안 신경 및 정신 질환에서 중심적인 역할을 입증했기 때문에 정신 질환에 대한 시스템의 신경 과학적 접근 방식에 최적입니다22,23. 우리의 접근 방식은 국소 파라크린 신호 전달에 관여하는 수많은 수용체와 리간드에서 동시에 신경교와 뉴런의 표현 반응을 측정할 수 있습니다. 실제로, 시그널링은 퍼지 로직(24)과 같은 다양한 정량적 방법을 사용하여 이들 데이터세트로부터 추론될 수 있다. 또한, 뉴런 또는 아교 세포에서 세포 하위 표현형과 그 기능을 식별하면 특정 핵의 뇌 세포가 단일 세포 수준에서 어떻게 조직, 반응 및 조절 장애에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 이 기능 시스템의 역학은 시계열 실험16으로도 모델링 할 수 있습니다. 마지막으로, 동물 모델은이 시스템의 접근 방식에 기계 론적 조건을 부여하기 위해 해부학 적 또는 약리학 적으로 교란 될 수 있습니다.
대표적인 실험:
아래에서는 이러한 방법의 적용 예를 제공합니다. 이 연구는 알코올 의존 및 후속 금단에 대한 반응으로 단독 핵 (NTS)에서 쥐 신경 및 미세 아교 세포 유전자 발현을 조사했습니다16. 쥐 코호트는 1) 대조군, 2) 에탄올 의존성 (EtOH), 3) 8 시간 철수 (Wd), 4) 32 시간 Wd 및 5) 176 h Wd로 구성되었습니다 (그림 1A). 빠른 참수 후, 뇌간을 전뇌에서 분리하고 냉동 절제하고, 티로신 하이드록실라제 양성(TH +) 뉴런과 미세아교세포에 대해 절편을 염색했습니다(그림 1B). LCM은 TH+ 및 TH- 뉴런과 미세아교세포 모두를 수집하는데 사용되었다. 모든 세포는 NTS에서 추출하고 10 세포 풀의 샘플로 분석했습니다. 4개의 96 x 96 마이크로유체 RT-qPCR 동적 어레이를 65개의 유전자를 측정하는 RT-qPCR 플랫폼에서 실행했습니다(그림 1B-C). 데이터는 -ΔΔCt 방법을 사용하여 정규화하고 R을 사용하여 분석했으며 단일 세포 선택은 분자 마커로 검증되었습니다 (그림 1D-E). 기술 검증은 단일 배치 내에서 그리고 배치 전반에 걸쳐 분석된 기술 복제에 의해 추가로 검증되었습니다(그림 2 및 그림 3). TH+ 및 TH- 뉴런은 유사한 염증성 유전자 클러스터를 갖지만 γ-아미노부티르산(GABA) 수용체(R) 클러스터가 다른 서로 다른 하위 표현형으로 구성됩니다(그림 4 및 그림 5). 염증성 유전자 클러스터의 발현이 상승한 하위 표현형은 32시간 Wd에서 과대 발현된 반면 GABA 수용체(GABAR) 발현은 장기간 알코올 금단(176시간 Wd)에서 낮게 유지되었습니다. 이 연구는 알코올 및 오피오이드 의존성에 대한 보상 반대 가설에 기여하며, 이는 금단 시 내장의 차단 피드백이 내장-정서적 뉴런 핵(즉, NTS 및 편도체)의 조절 장애에 기여하여 물질 의존에 기여하는 더 심각한 자율 및 정서적 후유증을 초래한다고 추측합니다(그림 6).
Protocol
Representative Results
Discussion
알코올 사용 장애는 치료하기 어려운 질병으로 남아 있습니다. 우리 그룹은 시스템 신경 과학적 관점에서 보상 방지 과정을 조사함으로써이 장애에 접근했습니다. 우리는 알코올 금단 시계열16에서 단일 NTS 뉴런과 미세아교세포의 유전자 발현 변화를 측정했습니다. NTS는 알코올 금단 증후군에서 발생하는 자율 조절 장애에서 두드러진 역할을 위해 선택되었습니다. 자사는 LCM을 …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
여기에 제시된 작업은 JS 및 RV에 수여 된 NIH HLB U01 HL133360, JS 및 EVB에 수여 된 NIDA R21 DA036372, SJO ‘S를 지원하기 위해 Jan Hoek에게 수여 된 T32 AA-007463 및 국립 알코올 중독 및 알코올 남용 연구소 : R01 AA018873을 통해 자금을 지원했습니다.
Materials
| 20X DNA Binding Dye | Fluidigm | 100-7609 | NA |
| 2x GE Assay Loading Reagent | Fluidigm | 85000802-R | NA |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (referred to as qPCR chip in text) | Fluidigm | BMK-M-96.96 | NA |
| Anti-Cd11β Antibody | Genway Biotech | CCEC48 | Microglia Stain |
| Anti-NeuN Antibody, clone A60 | EMD Millipore | MAB377 | Neuronal Stain |
| Anti-tyrosine hydroxylase antibody | abcam | ab112 | Stain for TH+ neurons |
| ArcturusXT Laser Capture Microdissection System | Arcturus | NA | NA |
| Biomark HD | Fluidigm | NA | RT-qPCR platform |
| Bovine Serum Antigen | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| CapSure Macro LCM Caps | ThermoFisher Scientific | LCM0211 | NA |
| CellDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher Scientific | 11753500 | Lysis buffer solution components |
| CellsDirect Resuspension & Lysis Buffer Kit | ThermoFisher Scientific | 11739010 | Invitrogen |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | Nucleus Stain |
| DNA Suspension Buffer | TEKnova | T0221 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | R37118 | Seconadry Antibody |
| Exonuclease I | New Englnad BioLabs, Inc. | M0293S | NA |
| ExtracSure Sample Extraction Device | ThermoFisher Scientific | LCM0208 | NA |
| FisherbrandTM Superfrost Plus Microscope Slides | ThermoFisher Scientific | 22-037-246 | Plain glass slides |
| GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube | ThermoFisher Scientific | N8010611 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclona Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A28180 | Seconadry Antibody |
| IFC Controller | Fluidigm | NA | NA |
| RNaseOut | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox | Bio-Rad | PN 172-5211 | NA |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | ThermoFisher Scientific | 11754250 | Contains VILO and SuperScript |
| T4 Gene 32 Protein | New Englnad BioLabs, Inc. | M0300S | NA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4391128 | NA |
| TE Buffer | TEKnova | T0225 | NA |
| TempPlate Semi-Skirted 96-Well PCR Plate, 0.2 mL | USA Scientific | 1402-9700 | NA |
Riferimenti
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