Kombinationen af laserfangstmikrodissektion og mikrofluidisk RT-qPCR giver anatomisk og bioteknisk specificitet ved måling af transkriptomet i enkeltneuroner og glia. Anvendelse af kreative metoder med et systems biologiske tilgang til psykiatrisk sygdom kan føre til gennembrud i forståelse og behandling såsom neuroinflammation antireward hypotesen i afhængighed.
Stigende afhængighedsadfærd har motiveret både forskere og klinikere inden for mental sundhed til at forstå antireward og genopretning. Dette skift væk fra belønning og begyndelse nødvendiggør nye perspektiver, paradigmer og hypoteser sammen med en udvidelse af de metoder, der anvendes til at undersøge afhængighed. Her giver vi et eksempel: En systembiologisk tilgang til at undersøge antireward, der kombinerer laserfangstmikrodissektion (LCM) og mikrofluidisk regultion kvantitative polymerasekædereaktioner (RT-qPCR) med høj kapacitet. Genekspressionsnetværksdynamik blev målt, og en vigtig drivkraft for neurovisceral dysregulering i alkohol- og opioidabstinenser, neuroinflammation, blev identificeret. Denne kombination af teknologier giver anatomisk og fænotypisk specificitet ved enkeltcelleopløsning med høj kapacitetsfølsomhed og specifikke genekspressionsmål, der giver både hypotesegenererende datasæt og mekaniske muligheder, der skaber muligheder for ny indsigt og behandlinger.
Afhængighed er fortsat en voksende udfordring i den udviklede verden 1,2. På trods af store videnskabelige og kliniske fremskridt fortsætter afhængighedsraterne med at stige, mens effektiviteten af etablerede behandlinger forbliver stabil i bedste fald 3,4,5. Imidlertid har fremskridt inden for bioteknologi og videnskabelige tilgange ført til nye metoder og hypoteser til yderligere at undersøge patofysiologien af stofafhængighed 6,7,8. Faktisk tyder den seneste udvikling på, at nye begreber og behandlingsparadigmer kan føre til gennembrud med sociale, økonomiske og politiske konsekvenser 9,10,11,12.
Vi undersøgte antireward i tilbagetrækning af alkohol- og opioidafhængighed13,14,15,16. Metoder er centrale for dette paradigme17,18. Laserfangstmikrodissektion (LCM) kan vælge enkeltceller med høj anatomisk specificitet. Denne funktionalitet er integreret i neuroinflammation antireward-hypotesen, da både glia og neuroner kan indsamles og analyseres fra den samme neuronale subnucleus i det samme dyr 13,14,15,16,19. En relevant del af transkriptomet af udvalgte celler kan derefter måles med mikrofluidiske kontratranskriptionsresponser med høj kapacitet kvantitative polymerasekædereaktioner (RT-qPCR), der giver højdimensionelle datasæt til beregningsanalyse, hvilket giver indsigt i funktionelle netværk20,21.
Måling af en delmængde af transkriptomet i neuroner og glia i en bestemt hjernekerne genererer et datasæt, der er robust i både prøveantal og gener målt og er følsomt og specifikt. Disse værktøjer er optimale for et systems neurovidenskabelige tilgang til psykiatrisk sygdom, fordi glia, hovedsageligt astrocytter og microglia, har vist en central rolle i neurologisk og psykiatrisk sygdom i løbet af det sidste årti22,23. Vores tilgang kan måle det ekspressive respons af glia og neuroner samtidigt på tværs af adskillige receptorer og ligander involveret i lokal parakrin signalering. Faktisk kan signalering udledes af disse datasæt ved hjælp af forskellige kvantitative metoder såsom fuzzy logik24. Endvidere kan identifikationen af cellulære subphenotyper i neuroner eller glia og deres funktion give indsigt i, hvordan hjerneceller i specifikke kerner organiserer, reagerer på og dysregulerer på enkeltcelleniveau. Dynamikken i dette funktionelle system kan også modelleres med tidsserieeksperimenter16. Endelig kan dyremodeller forstyrres anatomisk eller farmakologisk for at give en mekanistisk tilstand til dette systems tilgang.
Repræsentativt eksperiment:
Nedenfor giver vi et eksempel på anvendelsen af disse metoder. Denne undersøgelse undersøgte rotteneuronal og microglia-genekspression i den ensomme kerne (NTS) som reaktion på alkoholafhængighed og efterfølgende tilbagetrækning16. Rottekohorter bestod af 1) Kontrol, 2) Ethanolafhængig (EtOH), 3) 8 timers tilbagetrækning (Wd), 4) 32 h Wd og 5) 176 h Wd (figur 1A). Efter hurtig halshugning blev hjernestammer adskilt fra forhjernen og kryosektioneret, og skiver blev farvet for tyrosinhydroxylase-positive (TH +) neuroner og microglia (figur 1B). LCM blev brugt til at indsamle både TH+ og TH-neuroner og microglia. Alle cellerne var fra NTS og analyseret som prøver af 10-cellede puljer. Fire 96 x 96 mikrofluidiske RT-qPCR dynamiske arrays blev kørt på RT-qPCR-platformen, der målte 65 gener (figur 1B-C). Data blev normaliseret ved hjælp af en -ΔΔCt-metode og analyseret ved hjælp af R, og enkeltcellevalg blev valideret med molekylære markører (figur 1D-E). Teknisk validering blev yderligere verificeret af tekniske replikater analyseret inden for en enkelt batch og på tværs af batcher (figur 2 og figur 3). TH + og TH- neuroner organiseret i forskellige subfænotyper med lignende inflammatoriske genklynger, men forskellige γ-aminosmørsyre (GABA) receptor (R) klynger (figur 4 og figur 5). Subfænotyper, der havde forhøjet ekspression af inflammatoriske genklynger, var overrepræsenteret ved 32 h Wd, mens GABA-receptor (GABAR) ekspression forblev lav i langvarig alkoholudtagning (176 h Wd). Dette arbejde bidrager til antireward-hypotesen om alkohol- og opioidafhængighed, som formoder, at interceptiv feedback fra indvoldene ved tilbagetrækning bidrager til dysreguleringen af visceral-følelsesmæssige neuronale kerner (dvs. NTS og amygdala), hvilket resulterer i mere alvorlige autonome og følelsesmæssige følgevirkninger, som bidrager til stofafhængighed (figur 6).
Alkoholforstyrrelse er fortsat en udfordrende sygdom at behandle. Vores gruppe har nærmet sig denne lidelse ved at undersøge antireward-processer med et systemneurovidenskabeligt perspektiv. Vi målte genekspressionsændringer i enkelte NTS-neuroner og microglia i en alkoholabstinenstidsserie16. NTS blev valgt for sin fremtrædende rolle i den autonome dysregulering, der forekommer i alkoholabstinenssyndrom. Vi kombinerer LCM med encellet mikrofluidisk RT-qPCR, hvilket gør det muligt at måle e…
The authors have nothing to disclose.
Arbejdet, der præsenteres her, blev finansieret gennem NIH HLB U01 HL133360 tildelt JS og RV, NIDA R21 DA036372 tildelt JS og EVB, T32 AA-007463 tildelt Jan Hoek til støtte for SJO’S og National Institute of Alcoholism and Alcohol Abuse: R01 AA018873.
20X DNA Binding Dye | Fluidigm | 100-7609 | NA |
2x GE Assay Loading Reagent | Fluidigm | 85000802-R | NA |
96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (referred to as qPCR chip in text) | Fluidigm | BMK-M-96.96 | NA |
Anti-Cd11β Antibody | Genway Biotech | CCEC48 | Microglia Stain |
Anti-NeuN Antibody, clone A60 | EMD Millipore | MAB377 | Neuronal Stain |
Anti-tyrosine hydroxylase antibody | abcam | ab112 | Stain for TH+ neurons |
ArcturusXT Laser Capture Microdissection System | Arcturus | NA | NA |
Biomark HD | Fluidigm | NA | RT-qPCR platform |
Bovine Serum Antigen | Sigma-Aldrich | B4287 | |
CapSure Macro LCM Caps | ThermoFisher Scientific | LCM0211 | NA |
CellDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher Scientific | 11753500 | Lysis buffer solution components |
CellsDirect Resuspension & Lysis Buffer Kit | ThermoFisher Scientific | 11739010 | Invitrogen |
DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | Nucleus Stain |
DNA Suspension Buffer | TEKnova | T0221 | |
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | R37118 | Seconadry Antibody |
Exonuclease I | New Englnad BioLabs, Inc. | M0293S | NA |
ExtracSure Sample Extraction Device | ThermoFisher Scientific | LCM0208 | NA |
FisherbrandTM Superfrost Plus Microscope Slides | ThermoFisher Scientific | 22-037-246 | Plain glass slides |
GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube | ThermoFisher Scientific | N8010611 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclona Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A28180 | Seconadry Antibody |
IFC Controller | Fluidigm | NA | NA |
RNaseOut | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox | Bio-Rad | PN 172-5211 | NA |
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | ThermoFisher Scientific | 11754250 | Contains VILO and SuperScript |
T4 Gene 32 Protein | New Englnad BioLabs, Inc. | M0300S | NA |
TaqMan PreAmp Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4391128 | NA |
TE Buffer | TEKnova | T0225 | NA |
TempPlate Semi-Skirted 96-Well PCR Plate, 0.2 mL | USA Scientific | 1402-9700 | NA |