Onderzoek naar drivers van antireward in verslavingsgedrag met anatomisch specifieke eencellige genexpressiemethoden
Summary
De combinatie van laser capture microdissectie en microfluïdische RT-qPCR biedt anatomische en biotechnische specificiteit bij het meten van het transcriptoom in enkele neuronen en glia. Het toepassen van creatieve methoden met de biologische benadering van een systeem voor psychiatrische ziekten kan leiden tot doorbraken in begrip en behandeling, zoals de neuro-inflammatie antireward hypothese bij verslaving.
Abstract
Toenemende percentages van verslavingsgedrag hebben zowel onderzoekers als clinici in de geestelijke gezondheidszorg gemotiveerd om antireward en herstel te begrijpen. Deze verschuiving weg van beloning en begin vereist nieuwe perspectieven, paradigma’s en hypothesen, samen met een uitbreiding van de methoden die worden toegepast om verslaving te onderzoeken. Hier geven we een voorbeeld: een systeembiologische benadering om antireward te onderzoeken die laser capture microdissection (LCM) en high-throughput microfluïdische reverse transcriptie kwantitatieve polymeraseketenreacties (RT-qPCR) combineert. Genexpressie netwerkdynamiek werd gemeten en een belangrijke aanjager van neuroviscerale ontregeling in alcohol- en opioïde ontwenning, neuro-inflammatie, werd geïdentificeerd. Deze combinatie van technologieën biedt anatomische en fenotypische specificiteit bij eencellige resolutie met een hoge doorvoergevoeligheid en specifieke genexpressiemetingen die zowel hypothesegenererende datasets als mechanistische mogelijkheden opleveren die kansen genereren voor nieuwe inzichten en behandelingen.
Introduction
Verslaving blijft een groeiende uitdaging in de ontwikkelde wereld 1,2. Ondanks grote wetenschappelijke en klinische vooruitgang, blijft het aantal verslavingen toenemen, terwijl de werkzaamheid van gevestigde behandelingen stabiel blijft op zijn best 3,4,5. Vooruitgang in de biotechnologie en wetenschappelijke benaderingen hebben echter geleid tot nieuwe methoden en hypothesen om de pathofysiologie van stofafhankelijkheid verder te onderzoeken 6,7,8. Recente ontwikkelingen suggereren inderdaad dat nieuwe concepten en behandelingsparadigma’s kunnen leiden tot doorbraken met sociale, economische en politieke gevolgen 9,10,11,12.
We onderzochten antireward bij het afkicken van alcohol en opioïde afhankelijkheid 13,14,15,16. Methoden staan centraal in dit paradigma17,18. Laser capture microdissection (LCM) kan afzonderlijke cellen selecteren met een hoge anatomische specificiteit. Deze functionaliteit is een integraal onderdeel van de antirewardhypothese van neuro-inflammatie, aangezien zowel glia als neuronen kunnen worden verzameld en geanalyseerd van dezelfde neuronale subnucleus in hetzelfde dier 13,14,15,16,19. Een relevant deel van het transcriptoom van geselecteerde cellen kan vervolgens worden gemeten met high-throughput microfluïdische reverse transcriptie kwantitatieve polymeraseketenreacties (RT-qPCR) die hoogdimensionale datasets bieden voor computationele analyse die inzicht opleveren in functionele netwerken20,21.
Het meten van een subset van het transcriptoom in neuronen en glia in een specifieke hersenkern genereert een dataset die robuust is in zowel het aantal monsters als de gemeten genen en gevoelig en specifiek is. Deze hulpmiddelen zijn optimaal voor de neurowetenschappelijke benadering van psychiatrische aandoeningen door een systeem, omdat glia, voornamelijk astrocyten en microglia, het afgelopen decennium een centrale rol hebben aangetoond bij neurologische en psychiatrische aandoeningen22,23. Onze aanpak kan de expressieve respons van glia en neuronen gelijktijdig meten over tal van receptoren en liganden die betrokken zijn bij lokale paracriene signalering. Inderdaad, signalering kan worden afgeleid uit deze datasets met behulp van verschillende kwantitatieve methoden zoals fuzzy logic24. Verder kan de identificatie van cellulaire subfenotypes in neuronen of glia en hun functie inzicht geven in hoe hersencellen in specifieke kernen zich organiseren, reageren op en ontregelen op het niveau van één cel. De dynamiek van dit functionele systeem kan ook worden gemodelleerd met tijdreeksexperimenten16. Ten slotte kunnen diermodellen anatomisch of farmacologisch worden verstoord om de benadering van dit systeem een mechanistische voorwaarde te geven.
Representatief experiment:
Hieronder geven we een voorbeeld van de toepassing van deze methoden. Deze studie onderzocht de neuronale en microglia genexpressie van ratten in de solitaire kern (NTS) als reactie op alcoholafhankelijkheid en daaropvolgende terugtrekking16. Rattencohorten bestonden uit 1) Controle, 2) Ethanol-afhankelijk (EtOH), 3) 8 uur onttrekking (Wd), 4) 32 h Wd en 5) 176 h Wd (figuur 1A). Na snelle onthoofding werden hersenstamen gescheiden van de voorhersenen en gecryopiceerd, en plakjes werden gekleurd voor tyrosinehydroxylase-positieve (TH +) neuronen en microglia (figuur 1B). LCM werd gebruikt om zowel TH+ als TH- neuronen en microglia te verzamelen. Alle cellen waren afkomstig van de NTS en geanalyseerd als monsters van 10-celpools. Vier 96 x 96 microfluïdische RT-qPCR dynamische arrays werden uitgevoerd op het RT-qPCR-platform meten 65 genen (figuur 1B-C). Gegevens werden genormaliseerd met behulp van een -ΔΔCt-methode en geanalyseerd met behulp van R, en selectie van één cel werd gevalideerd met moleculaire markers (figuur 1D-E). Technische validatie werd verder geverifieerd door technische replica’s geanalyseerd binnen een enkele batch en over batches (figuur 2 en figuur 3). TH+ en TH- neuronen georganiseerd in verschillende subfenotypes met vergelijkbare inflammatoire genclusters, maar verschillend γ-aminoboterzuur (GABA) receptor (R) clusters (Figuur 4 en Figuur 5). Subfenotypen met verhoogde expressie van inflammatoire genclusters waren oververtegenwoordigd bij 32 h Wd, terwijl GABA-receptor (GABAR) expressie laag bleef in langdurige alcoholontwenning (176 h Wd). Dit werk draagt bij aan de antirewardhypothese van alcohol- en opioïdeafhankelijkheid die vermoedt dat interceptieve feedback van de ingewanden bij ontwenning bijdraagt aan de ontregeling van visceraal-emotionele neuronale kernen (d.w.z. NTS en amygdala), wat resulteert in ernstigere autonome en emotionele gevolgen, die bijdragen aan middelenafhankelijkheid (figuur 6).
Protocol
Representative Results
Discussion
Alcoholgebruiksstoornis blijft een uitdagende ziekte om te behandelen. Onze groep heeft deze aandoening benaderd door antirewardprocessen te onderzoeken met een systeem neurowetenschappelijk perspectief. We maten genexpressieveranderingen in enkele NTS-neuronen en microglia in een alcoholontwenningstijdreeks16. De NTS werd gekozen vanwege zijn prominente rol in de autonome ontregeling die optreedt bij alcoholontwenningssyndroom. We combineren LCM met eencellige microfluïdische RT-qPCR waardoor ro…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het hier gepresenteerde werk werd gefinancierd door NIH HLB U01 HL133360 toegekend aan JS en RV, NIDA R21 DA036372 toegekend aan JS en EVB, T32 AA-007463 toegekend aan Jan Hoek ter ondersteuning van SJO’s, en National Institute of Alcoholism and Alcohol Abuse: R01 AA018873.
Materials
| 20X DNA Binding Dye | Fluidigm | 100-7609 | NA |
| 2x GE Assay Loading Reagent | Fluidigm | 85000802-R | NA |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (referred to as qPCR chip in text) | Fluidigm | BMK-M-96.96 | NA |
| Anti-Cd11β Antibody | Genway Biotech | CCEC48 | Microglia Stain |
| Anti-NeuN Antibody, clone A60 | EMD Millipore | MAB377 | Neuronal Stain |
| Anti-tyrosine hydroxylase antibody | abcam | ab112 | Stain for TH+ neurons |
| ArcturusXT Laser Capture Microdissection System | Arcturus | NA | NA |
| Biomark HD | Fluidigm | NA | RT-qPCR platform |
| Bovine Serum Antigen | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| CapSure Macro LCM Caps | ThermoFisher Scientific | LCM0211 | NA |
| CellDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher Scientific | 11753500 | Lysis buffer solution components |
| CellsDirect Resuspension & Lysis Buffer Kit | ThermoFisher Scientific | 11739010 | Invitrogen |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | Nucleus Stain |
| DNA Suspension Buffer | TEKnova | T0221 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | R37118 | Seconadry Antibody |
| Exonuclease I | New Englnad BioLabs, Inc. | M0293S | NA |
| ExtracSure Sample Extraction Device | ThermoFisher Scientific | LCM0208 | NA |
| FisherbrandTM Superfrost Plus Microscope Slides | ThermoFisher Scientific | 22-037-246 | Plain glass slides |
| GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube | ThermoFisher Scientific | N8010611 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclona Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A28180 | Seconadry Antibody |
| IFC Controller | Fluidigm | NA | NA |
| RNaseOut | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox | Bio-Rad | PN 172-5211 | NA |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | ThermoFisher Scientific | 11754250 | Contains VILO and SuperScript |
| T4 Gene 32 Protein | New Englnad BioLabs, Inc. | M0300S | NA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4391128 | NA |
| TE Buffer | TEKnova | T0225 | NA |
| TempPlate Semi-Skirted 96-Well PCR Plate, 0.2 mL | USA Scientific | 1402-9700 | NA |
Riferimenti
- . Substance Use and Mental Health Indicators in the United States: Results from the 2019 National Survey on Drug Use and Health Available from: https://www.samhsa.gov/data/ (2020)
- Prevalence of Serious Mental Illness (SMI). NIH Available from: https://www.nimh.nih.gov/health/statistics/mental-illness.shtml (2020)
- Mattick, R. P., Kimber, J., Breen, C., Davoli, M., Mattick, R. P. Buprenorphine maintenance versus placebo or methadone maintenance for opioid dependence. Cochrane Database of Systematic Reviews. , (2008).
- Mattick, R. P., Breen, C., Kimber, J., Davoli, M. Methadone maintenance therapy versus no opioid replacement therapy for opioid dependence. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 2009 (3), (2009).
- Miller, P. M., Book, S. W., Stewart, S. H. Medical treatment of alcohol dependence: A systematic review. International Journal of Psychiatry in Medicine. 42 (3), 227-266 (2012).
- Holmes, E. A., et al. The Lancet Psychiatry Commission on psychological treatments research in tomorrow’s science. The Lancet. Psychiatry. 5 (3), 237-286 (2018).
- Ford, C. L., Young, L. J. Translational opportunities for circuit-based social neuroscience: advancing 21st century psychiatry. Current Opinion in Neurobiology. 68, 1-8 (2021).
- Holmes, E. A., Craske, M. G., Graybiel, A. M. Psychological treatments: A call for mental-health science. Nature. 511 (7509), 287-289 (2014).
- Miranda, A., Taca, A. Neuromodulation with percutaneous electrical nerve field stimulation is associated with reduction in signs and symptoms of opioid withdrawal: a multisite, retrospective assessment. The American Journal of Drug and Alcohol Abuse. 44 (1), 56-63 (2018).
- Metz, V. E., et al. Effects of ibudilast on the subjective, reinforcing, and analgesic effects of oxycodone in recently detoxified adults with opioid dependence. Neuropsychopharmacology. 42 (9), 1825-1832 (2017).
- Heinzerling, K. G., et al. placebo-controlled trial of targeting neuroinflammation with ibudilast to treat methamphetamine use disorder. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 15 (2), 238-248 (2020).
- Bogenschutz, M. P., et al. Psilocybin-assisted treatment for alcohol dependence: A proof-of-concept study. Journal of Psychopharmacology. 29 (3), 289-299 (2015).
- O’Sullivan, S. J., Schwaber, J. S. Similarities in alcohol and opioid withdrawal syndromes suggest common negative reinforcement mechanisms involving the interoceptive antireward pathway. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 125, 355-364 (2021).
- O’Sullivan, S. J. Single-cell systems neuroscience: A growing frontier in mental illness. Biocell. 46 (1), 7-11 (2022).
- O’Sullivan, S. J., et al. Single-cell glia and neuron gene expression in the central amygdala in opioid withdrawal suggests inflammation with correlated gut dysbiosis. Frontiers in Neuroscience. 13, 665 (2019).
- O’Sullivan, S. J., McIntosh-Clarke, D., Park, J., Vadigepalli, R., Schwaber, J. S. Single cell scale neuronal and glial gene expression and putative cell phenotypes and networks in the nucleus tractus solitarius in an alcohol withdrawal time series. Frontiers in Systems Neuroscience. 15, 739790 (2021).
- O’Sullivan, S. J., Reyes, B. A. S., Vadigepalli, R., Van Bockstaele, E. J., Schwaber, J. S. Combining laser capture microdissection and microfluidic qpcr to analyze transcriptional profiles of single cells: A systems biology approach to opioid dependence. Journal of Visualized Experiments. (157), e60612 (2020).
- Achanta, S., Vadigepalli, R. Single cell high-throughput qRT-PCR protocol. Protocols.io. , (2020).
- O’Sullivan, S. J. The interoceptive antireward pathway and gut dysbiosis in addiction. Journal of Psychiatry, Depression & Anxiety. 7 (40), 1-5 (2021).
- Park, J., et al. Single-cell transcriptional analysis reveals novel neuronal phenotypes and interaction networks involved in the central circadian clock. Frontiers in Neuroscience. 10, 481 (2016).
- Staehle, M. M., et al. Diurnal patterns of gene expression in the dorsal vagal complex and the central nucleus of the amygdala – Non-rhythm-generating brain regions. Frontiers in Neuroscience. 14, 375 (2020).
- Réus, G. Z., et al. The role of inflammation and microglial activation in the pathophysiology of psychiatric disorders. Neuroscienze. 300, 141-154 (2015).
- Zhang, X., et al. Role of astrocytes in major neuropsychiatric disorders. Neurochemical Research. 46 (10), 2715-2730 (2021).
- Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single cell transcriptional variability. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117 (1), 87-98 (2015).
- Lieber, C. S., DeCarli, L. M. An experimental model of alcohol feeding and liver injury in the baboon. Journal of Medical Primatology. 3 (3), 153-163 (1974).
- Lieber, C. S., Decarli, L. M. Animal models of chronic ethanol toxicity. Methods in Enzymology. 233, 585-594 (1994).
- Park, J., et al. Inputs drive cell phenotype variability. Genome Research. 24 (6), 930-941 (2014).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates: Hard Cover Edition. , (1982).
