Investigación de los impulsores de la antirecompensa en el comportamiento de adicción con métodos de expresión génica unicelular anatómicamente específicos
Summary
La combinación de microdisección de captura láser y RT-qPCR microfluídica proporciona especificidad anatómica y biotecnológica en la medición del transcriptoma en neuronas individuales y glía. La aplicación de métodos creativos con el enfoque biológico de un sistema para la enfermedad psiquiátrica puede conducir a avances en la comprensión y el tratamiento, como la hipótesis de la neuroinflamación antirecompensa en la adicción.
Abstract
El aumento de las tasas de comportamiento de adicción ha motivado a los investigadores de salud mental y a los médicos por igual a comprender la antirecompensa y la recuperación. Este alejamiento de la recompensa y el comienzo requiere nuevas perspectivas, paradigmas e hipótesis, junto con una expansión de los métodos aplicados para investigar la adicción. Aquí, proporcionamos un ejemplo: Un enfoque de biología de sistemas para investigar la antirecompensa que combina la microdisección de captura láser (LCM) y las reacciones en cadena de la polimerasa cuantitativa de transcripción inversa microfluídica de alto rendimiento (RT-qPCR). Se midió la dinámica de la red de expresión génica y se identificó un factor clave de la desregulación neurovisceral en la abstinencia de alcohol y opioides, la neuroinflamación. Esta combinación de tecnologías proporciona especificidad anatómica y fenotípica a resolución de una sola célula con sensibilidad de alto rendimiento y medidas específicas de expresión génica que producen tanto conjuntos de datos generadores de hipótesis como posibilidades mecanicistas que generan oportunidades para nuevos conocimientos y tratamientos.
Introduction
La adicción sigue siendo un desafío creciente en el mundo desarrollado 1,2. A pesar de los grandes avances científicos y clínicos, las tasas de adicción continúan aumentando, mientras que la eficacia de los tratamientos establecidos se mantiene estable en el mejor de los casos 3,4,5. Sin embargo, los avances en la biotecnología y los enfoques científicos han llevado a nuevos métodos e hipótesis para investigar más a fondo la fisiopatología de la dependencia de sustancias 6,7,8. De hecho, los desarrollos recientes sugieren que los conceptos novedosos y los paradigmas de tratamiento pueden conducir a avances con consecuencias sociales, económicas y políticas 9,10,11,12.
Se investigó la antirecompensa en la abstinencia del alcohol y la dependencia de opiáceos13,14,15,16. Los métodos son centrales para este paradigma17,18. La microdisección de captura láser (LCM) puede seleccionar células individuales con alta especificidad anatómica. Esta funcionalidad es parte integral de la hipótesis antirecompensa de la neuroinflamación, ya que tanto la glía como las neuronas pueden ser recolectadas y analizadas del mismo subnúcleo neuronal en el mismo animal 13,14,15,16,19. Una porción relevante del transcriptoma de las células seleccionadas se puede medir con reacciones en cadena cuantitativas de la polimerasa con transcripción inversa microfluídica de alto rendimiento (RT-qPCR) que proporcionan conjuntos de datos de alta dimensión para el análisis computacional que proporcionan información sobre redes funcionales20,21.
La medición de un subconjunto del transcriptoma en las neuronas y la glía en un núcleo cerebral específico genera un conjunto de datos que es robusto tanto en el número de muestras como en los genes medidos y es sensible y específico. Estas herramientas son óptimas para el enfoque neurocientífico de un sistema para la enfermedad psiquiátrica porque la glía, principalmente los astrocitos y la microglía, han demostrado un papel central en la enfermedad neurológica y psiquiátrica en la última década22,23. Nuestro enfoque puede medir la respuesta expresiva de la glía y las neuronas concomitantemente a través de numerosos receptores y ligandos involucrados en la señalización paracrina local. De hecho, la señalización se puede inferir de estos conjuntos de datos utilizando varios métodos cuantitativos, como la lógica difusa24. Además, la identificación de subfenotipos celulares en neuronas o glía y su función puede proporcionar información sobre cómo las células cerebrales en núcleos específicos organizan, responden y desregulan a nivel unicelular. La dinámica de este sistema funcional también puede ser modelada con experimentos de series temporales16. Por último, los modelos animales pueden ser perturbados anatómica o farmacológicamente para dar una condición mecanicista al enfoque de este sistema.
Experimento representativo:
A continuación, proporcionamos un ejemplo de la aplicación de estos métodos. Este estudio investigó la expresión del gen neuronal y microglia de rata en el núcleo solitario (NTS) en respuesta a la dependencia del alcohol y la posterior abstinencia16. Las cohortes de ratas comprendieron 1) Control, 2) Dependiente de etanol (EtOH), 3) 8 h de retiro (Wd), 4) 32 h Wd y 5) 176 h Wd (Figura 1A). Después de una rápida decapitación, los troncos encefálicos se separaron del cerebro anterior y se crioseccionaron, y se tiñeron cortes para neuronas tirosina hidroxilasa positivas (TH +) y microglia (Figura 1B). LCM se utilizó para recolectar neuronas TH + y TH y microglia. Todas las células eran del NTS y se analizaron como muestras de grupos de 10 células. Se ejecutaron cuatro matrices dinámicas RT-qPCR microfluídicas de 96 x 96 en la plataforma RT-qPCR que mide 65 genes (Figura 1B-C). Los datos se normalizaron utilizando un método -ΔΔCt y se analizaron utilizando R, y la selección de células individuales se validó con marcadores moleculares (Figura 1D-E). La validación técnica se verificó adicionalmente mediante réplicas técnicas analizadas dentro de un solo lote y en lotes (Figura 2 y Figura 3). Las neuronas TH + y TH organizadas en diferentes subfenotipos con grupos de genes inflamatorios similares pero diferentes grupos de receptores (R) del ácido γ-aminobutírico (GABA) (Figura 4 y Figura 5). Los subfenotipos que tenían una expresión elevada de grupos de genes inflamatorios estaban sobrerrepresentados a las 32 h Wd, mientras que la expresión del receptor GABA (GABAR) se mantuvo baja en la abstinencia prolongada de alcohol (176 h Wd). Este trabajo contribuye a la hipótesis antirecompensa de la dependencia del alcohol y los opioides que conjetura que la retroalimentación interceptiva de las vísceras en la abstinencia contribuye a la desregulación de los núcleos neuronales viscerales-emocionales (es decir, NTS y amígdala) que resultan en secuelas autonómicas y emocionales más graves, que contribuyen a la dependencia de sustancias (Figura 6).
Protocol
Representative Results
Discussion
El trastorno por consumo de alcohol sigue siendo una enfermedad difícil de tratar. Nuestro grupo ha abordado este trastorno investigando procesos antirecompensa con una perspectiva de neurociencia de sistemas. Medimos los cambios en la expresión génica en neuronas NTS individuales y microglia en una serie de tiempo de abstinencia de alcohol16. El NTS fue elegido por su papel prominente en la desregulación autonómica que ocurre en el síndrome de abstinencia de alcohol. Combinamos LCM con RT-q…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El trabajo presentado aquí fue financiado a través de NIH HLB U01 HL133360 otorgado a JS y RV, NIDA R21 DA036372 otorgado a JS y EVB, T32 AA-007463 otorgado a Jan Hoek en apoyo de SJO’S, e Instituto Nacional de Alcoholismo y Abuso de Alcohol: R01 AA018873.
Materials
| 20X DNA Binding Dye | Fluidigm | 100-7609 | NA |
| 2x GE Assay Loading Reagent | Fluidigm | 85000802-R | NA |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (referred to as qPCR chip in text) | Fluidigm | BMK-M-96.96 | NA |
| Anti-Cd11β Antibody | Genway Biotech | CCEC48 | Microglia Stain |
| Anti-NeuN Antibody, clone A60 | EMD Millipore | MAB377 | Neuronal Stain |
| Anti-tyrosine hydroxylase antibody | abcam | ab112 | Stain for TH+ neurons |
| ArcturusXT Laser Capture Microdissection System | Arcturus | NA | NA |
| Biomark HD | Fluidigm | NA | RT-qPCR platform |
| Bovine Serum Antigen | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| CapSure Macro LCM Caps | ThermoFisher Scientific | LCM0211 | NA |
| CellDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher Scientific | 11753500 | Lysis buffer solution components |
| CellsDirect Resuspension & Lysis Buffer Kit | ThermoFisher Scientific | 11739010 | Invitrogen |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | Nucleus Stain |
| DNA Suspension Buffer | TEKnova | T0221 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | R37118 | Seconadry Antibody |
| Exonuclease I | New Englnad BioLabs, Inc. | M0293S | NA |
| ExtracSure Sample Extraction Device | ThermoFisher Scientific | LCM0208 | NA |
| FisherbrandTM Superfrost Plus Microscope Slides | ThermoFisher Scientific | 22-037-246 | Plain glass slides |
| GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube | ThermoFisher Scientific | N8010611 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclona Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A28180 | Seconadry Antibody |
| IFC Controller | Fluidigm | NA | NA |
| RNaseOut | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox | Bio-Rad | PN 172-5211 | NA |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | ThermoFisher Scientific | 11754250 | Contains VILO and SuperScript |
| T4 Gene 32 Protein | New Englnad BioLabs, Inc. | M0300S | NA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4391128 | NA |
| TE Buffer | TEKnova | T0225 | NA |
| TempPlate Semi-Skirted 96-Well PCR Plate, 0.2 mL | USA Scientific | 1402-9700 | NA |
Riferimenti
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