Kombinationen av laserfångande mikrodissektion och mikrofluidisk RT-qPCR ger anatomisk och bioteknisk specificitet vid mätning av transkriptomet i enskilda neuroner och glia. Att tillämpa kreativa metoder med ett systems biologiska förhållningssätt till psykiatrisk sjukdom kan leda till genombrott i förståelse och behandling såsom neuroinflammation antireward-hypotesen vid missbruk.
Ökande nivåer av missbruksbeteende har motiverat både forskare inom psykisk hälsa och kliniker att förstå antireward och återhämtning. Detta skifte bort från belöning och början kräver nya perspektiv, paradigmer och hypoteser tillsammans med en utvidgning av de metoder som tillämpas för att undersöka missbruk. Här ger vi ett exempel: En systembiologisk metod för att undersöka antireward som kombinerar laserinfångningsmikrodissektion (LCM) och mikrofluidiska kvantitativa transkriptionskvantitativa polymeraskedjereaktioner (RT-qPCR) med hög genomströmning. Genuttrycksnätverksdynamik mättes och en viktig drivkraft för neurovisceral dysreglering vid alkohol- och opioidabstinens, neuroinflammation, identifierades. Denna kombination av tekniker ger anatomisk och fenotypisk specificitet vid encellsupplösning med hög genomströmningskänslighet och specifika genuttrycksmått som ger både hypotesgenererande datamängder och mekanistiska möjligheter som genererar möjligheter till nya insikter och behandlingar.
Beroende är fortfarande en växande utmaning i den utvecklade världen 1,2. Trots stora vetenskapliga och kliniska framsteg fortsätter beroendegraden att öka medan effekten av etablerade behandlingar förblir stabil i bästa fall 3,4,5. Framsteg inom bioteknik och vetenskapliga tillvägagångssätt har dock lett till nya metoder och hypoteser för att ytterligare undersöka patofysiologin för substansberoende 6,7,8. Den senaste utvecklingen tyder faktiskt på att nya begrepp och behandlingsparadigmer kan leda till genombrott med sociala, ekonomiska och politiska konsekvenser 9,10,11,12.
Vi undersökte antireward vid uttag av alkohol- och opioidberoende13,14,15,16. Metoder är centrala för detta paradigm17,18. Laserfångande mikrodissektion (LCM) kan välja enstaka celler med hög anatomisk specificitet. Denna funktionalitet är integrerad i neuroinflammation antireward-hypotesen eftersom både glia och neuroner kan samlas in och analyseras från samma neuronala subnukleus i samma djur 13,14,15,16,19. En relevant del av transkriptomet för utvalda celler kan sedan mätas med mikrofluidiska omvända transkriptionskvantitativa polymeraskedjereaktioner (RT-qPCR) med hög genomströmning som ger högdimensionella datamängder för beräkningsanalys som ger insikter i funktionella nätverk20,21.
Att mäta en delmängd av transkriptomet i nervceller och glia i en specifik hjärnkärna genererar en dataset som är robust i både provantal och uppmätta gener och är känslig och specifik. Dessa verktyg är optimala för ett systems neurovetenskapliga tillvägagångssätt för psykiatrisk sjukdom eftersom glia, främst astrocyter och microglia, har visat en central roll i neurologisk och psykiatrisk sjukdom under det senaste decenniet22,23. Vårt tillvägagångssätt kan mäta det uttrycksfulla svaret från glia och neuroner samtidigt över många receptorer och ligander som är involverade i lokal parakrin signalering. Faktum är att signalering kan härledas från dessa datamängder med hjälp av olika kvantitativa metoder som fuzzy logic24. Vidare kan identifieringen av cellulära subfenotyper i neuroner eller glia och deras funktion ge insikt i hur hjärnceller i specifika kärnor organiserar, svarar på och dysreglerar på encellsnivå. Dynamiken i detta funktionella system kan också modelleras med tidsserieexperiment16. Slutligen kan djurmodeller störas anatomiskt eller farmakologiskt för att ge ett mekanistiskt tillstånd till detta systems tillvägagångssätt.
Representativt experiment:
Nedan ger vi ett exempel på tillämpningen av dessa metoder. Denna studie undersökte råttneuronala och mikroglia-genuttryck i den ensamma kärnan (NTS) som svar på alkoholberoende och efterföljande tillbakadragande16. Råttkohorter omfattade 1) Kontroll, 2) Etanolberoende (EtOH), 3) 8 h abstinens (Wd), 4) 32 h Wd och 5) 176 h Wd (Figur 1A). Efter snabb halshuggning separerades hjärnstammar från framhjärnan och kryosektionerades, och skivor färgades för tyrosinhydroxylaspositiva (TH +) neuroner och mikroglia (figur 1B). LCM användes för att samla in både TH+ och TH- neuroner och microglia. Alla celler var från NTS och analyserades som prover av 10-cellspooler. Fyra 96 x 96 mikrofluidiska RT-qPCR dynamiska arrays kördes på RT-qPCR-plattformen som mäter 65 gener (figur 1B-C). Data normaliserades med hjälp av en -ΔΔCt-metod och analyserades med R, och encellsval validerades med molekylära markörer (figur 1D-E). Teknisk validering verifierades ytterligare av tekniska replikat som analyserades inom en enda sats och mellan satser (figur 2 och figur 3). TH + och TH- neuroner organiserade i olika subfenotyper med liknande inflammatoriska genkluster men olika γ-aminosmörsyra (GABA) receptor (R) kluster (Figur 4 och Figur 5). Subfenotyper som hade förhöjt uttryck av inflammatoriska genkluster var överrepresenterade vid 32 h Wd medan GABA-receptor (GABAR) uttryck förblev lågt vid långvarig alkoholabstinens (176 h Wd). Detta arbete bidrar till antireward-hypotesen om alkohol- och opioidberoende som antar att avlyssnande återkoppling från inälvorna i abstinens bidrar till dysreglering av visceral-emotionella neuronala kärnor (dvs. NTS och amygdala) vilket resulterar i allvarligare autonoma och känslomässiga följder, vilket bidrar till substansberoende (Figur 6).
Alkoholanvändningsstörning är fortfarande en utmanande sjukdom att behandla. Vår grupp har närmat sig denna sjukdom genom att undersöka antireward-processer med ett systemneurovetenskapligt perspektiv. Vi mätte genuttrycksförändringar i enstaka NTS-neuroner och mikroglia i en alkoholabstinenstidsserie16. NTS valdes för sin framträdande roll i den autonoma dysreglering som uppstår vid alkoholabstinenssyndrom. Vi kombinerar LCM med encellig mikrofluidisk RT-qPCR vilket möjliggör robust…
The authors have nothing to disclose.
Arbetet som presenteras här finansierades genom NIH HLB U01 HL133360 som tilldelades JS och RV, NIDA R21 DA036372 tilldelades JS och EVB, T32 AA-007463 tilldelades Jan Hoek till stöd för SJO’S och National Institute of Alcoholism and Alcohol Abuse: R01 AA018873.
20X DNA Binding Dye | Fluidigm | 100-7609 | NA |
2x GE Assay Loading Reagent | Fluidigm | 85000802-R | NA |
96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (referred to as qPCR chip in text) | Fluidigm | BMK-M-96.96 | NA |
Anti-Cd11β Antibody | Genway Biotech | CCEC48 | Microglia Stain |
Anti-NeuN Antibody, clone A60 | EMD Millipore | MAB377 | Neuronal Stain |
Anti-tyrosine hydroxylase antibody | abcam | ab112 | Stain for TH+ neurons |
ArcturusXT Laser Capture Microdissection System | Arcturus | NA | NA |
Biomark HD | Fluidigm | NA | RT-qPCR platform |
Bovine Serum Antigen | Sigma-Aldrich | B4287 | |
CapSure Macro LCM Caps | ThermoFisher Scientific | LCM0211 | NA |
CellDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher Scientific | 11753500 | Lysis buffer solution components |
CellsDirect Resuspension & Lysis Buffer Kit | ThermoFisher Scientific | 11739010 | Invitrogen |
DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | Nucleus Stain |
DNA Suspension Buffer | TEKnova | T0221 | |
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | R37118 | Seconadry Antibody |
Exonuclease I | New Englnad BioLabs, Inc. | M0293S | NA |
ExtracSure Sample Extraction Device | ThermoFisher Scientific | LCM0208 | NA |
FisherbrandTM Superfrost Plus Microscope Slides | ThermoFisher Scientific | 22-037-246 | Plain glass slides |
GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube | ThermoFisher Scientific | N8010611 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclona Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A28180 | Seconadry Antibody |
IFC Controller | Fluidigm | NA | NA |
RNaseOut | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox | Bio-Rad | PN 172-5211 | NA |
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | ThermoFisher Scientific | 11754250 | Contains VILO and SuperScript |
T4 Gene 32 Protein | New Englnad BioLabs, Inc. | M0300S | NA |
TaqMan PreAmp Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4391128 | NA |
TE Buffer | TEKnova | T0225 | NA |
TempPlate Semi-Skirted 96-Well PCR Plate, 0.2 mL | USA Scientific | 1402-9700 | NA |