Ett enkelt pitanalysprotokoll för att visualisera och kvantifiera osteoklastisk resorption in vitro
Summary
Här presenterar vi ett enkelt och effektivt analysförfarande för resorptionsgropsanalyser med användning av kalciumfosfatbelagda cellodlingsplattor.
Abstract
Mogna osteoklaster är flerkärniga celler som kan bryta ner ben genom utsöndring av syror och enzymer. De spelar en avgörande roll vid olika sjukdomar (t.ex. benskörhet och skelettcancer) och är därför viktiga forskningsobjekt. In vitro kan deras aktivitet analyseras genom bildandet av resorptionsgropar. I detta protokoll beskriver vi en enkel gropanalysmetod med kalciumfosfat (CaP) belagda cellodlingsplattor, som enkelt kan visualiseras och kvantifieras. Osteoklastprekursorer härledda från humana mononukleära celler i perifert blod (PBMC) odlades på de belagda plattorna i närvaro av osteoklastrogena stimuli. Efter 9 dagars inkubation fixerades osteoklaster och färgades för fluorescensavbildning medan CaP-beläggningen motverkades av kalcein. För att kvantifiera det resorberade området färgades CaP-beläggningen på plattor med 5% AgNO3 och visualiserades genom ljusfältsavbildning. Resorptionsgropen kvantifierades med hjälp av ImageJ.
Introduction
Osteoklaster (OC) är vävnadsspecifika makrofager härledda från hematopoetiska stamceller (HSC), som spelar en avgörande roll vid ombyggnad av ben tillsammans med osteoblaster1. Könshormoninducerad, immunologisk och maligna bensjukdomar som förstör ben systemiskt eller lokalt beror på överskott av osteoklastisk aktivitet, inklusive klimakteriet-relaterad osteoporos2, reumatoid artrit3, periodontal sjukdom4, myelom bensjukdom5 och osteolytisk benmetastas6. Däremot kan defekter i OC-bildning och funktion också orsaka osteopetros7. HSC genomgår differentiering till OC-förfäder under makrofagkolonistimulerande faktor (M-CSF, gensymbol ACP5) stimulering. I närvaro av både M-CSF och receptoraktivator av NF-κB-ligand (RANKL, gensymbol TNFSF11) differentierar OC-förfäder ytterligare till mononukleära OC och smälter därefter samman för att bli flerkärniga OC 8,9,10. Båda cytokinerna M-CSF och RANKL är oumbärliga och tillräckliga för induktion av osteoklastiska markörer såsom kalcitoninreceptor (CT), receptoraktivator för kärnfaktor κ B (RANK), protonpump V-ATPas, kloridkanal 7 alfa-underenhet (CIC-7), integrin β3, tartratresistent syrafosfatas (TRAP, gensymbol ACP5), lysosomal cysteinproteaskathepsin K (CTSK) och matrismetallopeptidas 9 (MMP9). Aktiverade OC bildar en tätningszon på benytan genom bildandet av en aktinring med en ruffad kant11,12. Inom tätningszonen förmedlar OC: er resorption genom att utsöndra protoner via protonpumpen V-ATPase12,13, MMP914 och CTSK15, vilket leder till bildandet av lacunae.
För in vitro-experiment kan OC-förfäder erhållas genom expansion av benmärgsmakrofager från möss lårben och skenben16,17, samt genom isolering av humana mononukleära celler i perifert blod (PBMC) från blodprover och buffy coats 18,19,20, eller genom differentiering av de odödliga murina monocytiska cellerna RAW 264,7 21,22.
I detta protokoll beskriver vi en osteoklastisk resorptionsanalys i CaP-belagda cellodlingsplattor med användning av OC: er härledda från primära PBMC. Metoden med CaP-belagda cellodlingsplattor som används här antas och förfinas från den metod som beskrivits tidigare av Patntirapong et al.17 och Maria et al.21. För att erhålla OC-prekursorer isoleras PBMC genom densitetsgradientcentrifugering och expanderas enligt beskrivningen tidigare20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskriver vi en enkel och tillförlitlig metod för en osteoklastisk resorptionsanalys med användning av OC härledda och expanderade in vitro från PBMC. De använda CaP-belagda cellodlingsplattorna kan enkelt förberedas och visualiseras med hjälp av laboratorietillgängliga material. Förutom osorterade PBMC som antagits i detta protokoll har OC: er genererade från murina monocytiska celler21 och benmärgsmakrofagceller17 också odlats på liknande synte…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete finansierades delvis av China Scholarship Council [CSC nr 201808440394]. W.C. finansierades av CSC.
Materials
| AgNO3 | SERVA Electrophoresis GmbH | 35110 | Silver nitrate |
| a-MEM | Gibco | 32561-029 | MEM alpha, GlutaMAX, no nucleosides |
| amphotericin B | Biochrom | 03-028-1B | Amphotericin B Solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21097-50G | Calcium chloride Dihydrate |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | Calcein |
| FBS | Sigma-Aldrich | F7524 | fetal bovine serum |
| Ficoll | Cytiva | 17144002 | Ficoll Paque Plus |
| Fixation buffer | Biolegend | 420801 | Paraformaldehyde |
| HCl | Merk | 1.09057.1000 | Hydrochloric acid |
| Hoechst 33342 | Promokine | PK-CA707-40046 | Hoechst 33342 |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | Recombinant Human M-CSF |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | Magnesium chloride |
| Na2HPO4 | AppliChem GmbH | A2943,0250 | di- Sodium hydrogen phosphate anhydrous |
| NaCl | Merk | S7653-250G | Sodium chloride |
| NaHCO3 | Merk | K15322429 | Bicarbonate of Soda |
| PBS | Lonza | 17-512F | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X), DBPS without Calcium and Magnesium |
| Pen-Strep | Lonza | DE17-602E | Penicillin-Streptomycin Mixture |
| Phalloidin-Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A22283 | Alexa Fluor 546 Phalloidin |
| RANKL | PeproTech | 310-01 | Recombinant Human sRANK Ligand (E.coli derived) |
| Tris | Sigma-Aldrich | 93362 | Tris(hydroxymethyl)aminomethan |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Alkyl Phenyl Polyethylene Glycol |
| TrypLE Express | Gibco | 12605010 | Recombinant cell-dissociation enzymes |
Riferimenti
- Jacome-Galarza, C. E., et al. Developmental origin, functional maintenance and genetic rescue of osteoclasts. Nature. 568 (7753), 541-545 (2019).
- Moller, A. M. J., et al. Aging and menopause reprogram osteoclast precursors for aggressive bone resorption. Bone Research. 8 (1), 1-11 (2020).
- Yokota, K., et al. Characterization and function of tumor necrosis factor and interleukin-6-induced osteoclasts in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheumatology. 73 (7), 1145-1154 (2021).
- Teng, Y. T., et al. Functional human T-cell immunity and osteoprotegerin ligand control alveolar bone destruction in periodontal infection. Journal of Clinical Investigation. 106 (6), 59-67 (2000).
- Terpos, E., et al. Soluble receptor activator of nuclear factor kappaB ligand-osteoprotegerin ratio predicts survival in multiple myeloma: proposal for a novel prognostic index. Blood. 102 (3), 1064-1069 (2003).
- Morony, S., et al. Osteoprotegerin inhibits osteolysis and decreases skeletal tumor burden in syngeneic and nude mouse models of experimental bone metastasis. Ricerca sul cancro. 61 (11), 4432-4436 (2001).
- Sobacchi, C., Schulz, A., Coxon, F. P., Villa, A., Helfrich, M. H. Osteopetrosis: genetics, treatment and new insights into osteoclast function. Nature Reviews Endocrinology. 9 (9), 522-536 (2013).
- Amarasekara, D. S., et al. Regulation of osteoclast differentiation by cytokine networks. Immune Network. 18 (1), 8 (2018).
- Kim, J. M., Lin, C., Stavre, Z., Greenblatt, M. B., Shim, J. H. Osteoblast-osteoclast communication and bone homeostasis. Cells. 9 (9), (2020).
- Teitelbaum, S. L. Bone resorption by osteoclasts. Science. 289 (5484), 1504-1508 (2000).
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
- Baron, R., Neff, L., Louvard, D., Courtoy, P. J. Cell-mediated extracellular acidification and bone resorption: evidence for a low pH in resorbing lacunae and localization of a 100-kD lysosomal membrane protein at the osteoclast ruffled border. Journal of Cell Biology. 101 (6), 2210-2222 (1985).
- Blair, H. C., Teitelbaum, S. L., Ghiselli, R., Gluck, S. Osteoclastic bone resorption by a polarized vacuolar proton pump. Science. 245 (4920), 855-857 (1989).
- Zhu, L., et al. Osteoclast-mediated bone resorption is controlled by a compensatory network of secreted and membrane-tethered metalloproteinases. Science Translational Medicine. 12 (529), 6143 (2020).
- Gowen, M., et al. Cathepsin K knockout mice develop osteopetrosis due to a deficit in matrix degradation but not demineralization. The Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1654-1663 (1999).
- Abu-Amer, Y. IL-4 abrogates osteoclastogenesis through STAT6-dependent inhibition of NF-kappaB. Journal of Clinical Investigation. 107 (11), 1375-1385 (2001).
- Patntirapong, S., Habibovic, P., Hauschka, P. V. Effects of soluble cobalt and cobalt incorporated into calcium phosphate layers on osteoclast differentiation and activation. Biomaterials. 30 (4), 548-555 (2009).
- Sorensen, M. G., et al. Characterization of osteoclasts derived from CD14+ monocytes isolated from peripheral blood. The Journal of Bone and Mineral Metabolism. 25 (1), 36-45 (2007).
- Kumar, A., et al. Synergistic effect of biphasic calcium phosphate and platelet-rich fibrin attenuate markers for inflammation and osteoclast differentiation by suppressing NF-kappaB/MAPK signaling pathway in chronic periodontitis. Molecules. 26 (21), 6578 (2021).
- Henriksen, K., Karsdal, M. A., Taylor, A., Tosh, D., Coxon, F. P. Generation of human osteoclasts from peripheral blood. Methods in Molecular Biology. 816, 159-175 (2012).
- Maria, S. M., et al. Reproducible quantification of osteoclastic activity: characterization of a biomimetic calcium phosphate assay. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 102 (5), 903-912 (2014).
- Kong, L., Smith, W., Hao, D. Overview of RAW264.7 for osteoclastogensis study: Phenotype and stimuli. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (5), 3077-3087 (2019).
- Li, P., et al. Systemic tumor necrosis factor alpha mediates an increase in peripheral CD11bhigh osteoclast precursors in tumor necrosis factor alpha-transgenic mice. Arthritis & Rheumatology. 50 (1), 265-276 (2004).
- Arai, F., et al. Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors. Journal of Experimental Medicine. 190 (12), 1741-1754 (1999).
- Xing, L., et al. NF-kappaB p50 and p52 expression is not required for RANK-expressing osteoclast progenitor formation but is essential for RANK- and cytokine-mediated osteoclastogenesis. The Journal of Bone and Mineral Research. 17 (7), 1200-1210 (2002).
- Miyamoto, T., et al. Bifurcation of osteoclasts and dendritic cells from common progenitors. Blood. 98 (8), 2544-2554 (2001).
