Il tratto gastrointestinale è uno degli organi più sensibili alle lesioni sui trattamenti radioterapeutici contro il cancro. È allo stesso tempo un sistema di organi con una delle più alte capacità rigenerative a seguito di tali insulti. Il protocollo presentato descrive un metodo efficace per studiare la capacità rigenerativa dell'epitelio intestinale.
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Articolo metodologico
Rigenerazione epiteliale intestinale in risposta all'irradiazione ionizzante
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'epitelio intestinale è costituito da un singolo strato di cellule ma contiene più tipi di cellule terminalmente differenziate, che sono generate dalla proliferazione attiva delle cellule staminali intestinali situate sul fondo delle cripte intestinali. Tuttavia, durante gli eventi di danno intestinale acuto, queste cellule staminali intestinali attive subiscono la morte cellulare. L'irradiazione gamma è un trattamento del cancro del colon-retto ampiamente utilizzato che, sebbene terapeuticamente efficace, ha l'effetto collaterale di esaurire il pool di cellule staminali attive. Infatti, i pazienti sperimentano frequentemente la sindrome da radiazioni gastrointestinali durante la radioterapia, in parte a causa della deplezione di cellule staminali attive. La perdita di cellule staminali intestinali attive nelle cripte intestinali attiva un pool di cellule staminali intestinali di riserva tipicamente quiescenti e induce la dedifferenziazione delle cellule precursori secretorie ed enterocitarie. Se non fosse per queste cellule, l'epitelio intestinale mancherebbe della capacità di recuperare dalla radioterapia e da altri importanti insulti tissutali. I nuovi progressi nelle tecnologie di tracciamento del lignaggio consentono il monitoraggio dell'attivazione, della differenziazione e della migrazione delle cellule durante la rigenerazione e sono stati impiegati con successo per studiarlo nell'intestino. Questo studio mira a rappresentare un metodo per l'analisi delle cellule all'interno dell'epitelio intestinale del topo dopo lesioni da radiazioni.
Introduzione
L'epitelio intestinale umano coprirebbe approssimativamente la superficie di mezzo campo da badminton se posizionato completamente piatto1. Invece, questo singolo strato cellulare che separa gli esseri umani dal contenuto delle loro viscere è compattato in una serie di proiezioni simili a dita, villi e rientranze, cripte che massimizzano la superficie dell'intestino. Le cellule dell'epitelio si differenziano lungo un asse crypt-villus. I villi sono costituiti principalmente da enterociti che assorbono i nutrienti, cellule caliciformi che secernono muco e cellule enteroendocrine che producono ormoni, mentre le cripte consistono principalmente di....
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Protocollo
Tutti i topi sono stati ospitati nella Division of Laboratory Animal Resources (DLAR) della Stony Brook University. Il Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Stony Brook University (IACUC) ha approvato tutti gli studi e le procedure che coinvolgono soggetti animali. Gli esperimenti che coinvolgono soggetti animali sono stati condotti rigorosamente in conformità con il protocollo di gestione degli animali approvato (IACUC # 245094).
NOTA: I ceppi di topo B6;129-Bmi1 tm1(cre/ERT)Mrc/J (Bmi1-Cre ER) e B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J (Rosa26eYFP) sono stati ottenuti commercial....
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Risultati
L'uso dell'irradiazione totale corporea (TBI) a 12 Gy in combinazione con il tracciamento del lignaggio genetico murino consente un'analisi approfondita delle conseguenze delle lesioni da radiazioni nell'intestino. Per iniziare, Bmi1-CreER; I topi Rosa26eYFP hanno ricevuto una singola iniezione di tamoxifene, che induce una maggiore espressione di proteine fluorescenti gialle (EYFP) all'interno di una popolazione di cellule staminali di riserva Bmi1+ . Due giorni dopo l'iniezione.......
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Discussione
Questo protocollo descrive un modello di danno da radiazioni robusto e riproducibile. Consente l'analisi precisa dei cambiamenti nell'epitelio intestinale nel corso di 7 giorni dopo l'infortunio. È importante sottolineare che i punti temporali selezionati riflettono fasi cruciali della lesione e sono caratterizzati da distinte alterazioni dell'intestino (lesioni, apoptosi, rigenerazione e fasi di normalizzazione)60. Questo modello di irradiazione è stato stabilito e attentamente valutato, dimostra.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano riconoscere lo Stony Brook Cancer Center Histology Research Core per l'assistenza di esperti nella preparazione dei campioni di tessuto e la Divisione delle risorse animali da laboratorio presso la Stony Brook University per l'assistenza nella cura e nella gestione degli animali. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del National Institutes of Health DK124342 assegnate ad Agnieszka B. Bialkowska e DK052230 al Dr. Vincent W. Yang.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Siringa da 1 ml | BD | ||
| 309659-16G Aghi riutilizzabili per l'alimentazione di piccoli animali: Dritto | VWR | 20068-630-27G | |
| x 1/2" ago | BD | ||
| 305109-28G x 1/2" Siringa da insulina monogetto da 1 ml | Covidien | ||
| 1188128012-5-Etinil-2′-deossiuridina (EdU) | Santa Cruz Biotechnology | sc284628A | 10 mg/mL in DMSO:acqua sterile (1:4 v/v), aliquotare e conservare in -20° C |
| Azer Scientific 10% Formalina tamponata neutra | Fisher Scientific | 22-026-213-B6.129X1-GT | |
| (ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J | laboratorio Jackson | #:006148 | |
| B6; 129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/J | The Jackson Laboratory | Strain #:010531 | |
| Siero bovino Albumina Frazione V, shock termico | Millipore-Sigma | 3116956001 | |
| Pollo anti-GFP | Aves | GFP-1020 | |
| Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 kit di imaging, Invitrogen | Thermo Fisher Scientific | C10638-Olio | |
| mais | Millipore-Sigma | C8267-Camera | |
| di decloaking | Biocare Medical | DC2012-Dimetil | |
| solfossido (DMSO) | Fisher BioReagents | BP231-100 | sensibile alla luce |
| proteinasi libera da DNasi K | Invitrogen | C10618H | diluito 25x in DPBS |
| Donkey anti-chicken AF647 | Jackson ImmunoResearch | 703-605-155 | |
| DPBS | Fisher Scientific | 21-031-CV-Eosin | |
| Fisher Scientific | S176 | ||
| Microscopio a fluorescenza Nikon Eclipse 90i Luce brillante e fluorescente, con obiettivi: 10X, 20X | Nikon | ||
| Fluoromount Aquoso Montaggio Medio | Millipore-Sigma | F4680-25ML | |
| Gamma Cell 40 Exactor | Best Theratronics Ltd. | - | 0,759 Gy min-1 |
| Capra anti-coniglio AF488 | Jackson ImmunoResearch | 111-545-144 | |
| Soluzione di ematossilina, Gill n. 3 | Millipore-Sigma | GHS332 | |
| HM 325 Microtomo rotante di Thermo Scientific | Fisher Scientific | 23-900-668 | |
| Hoechst 33258, pentaidrato (bis-benzimide) | Thermo Fisher Scientific | Diluizione H3569 | :1000 |
| Soluzione di perossido di idrogeno, ACS, 29-32%, Spectrum Chemical | Fisher Scientific | 18-603-252-Kit | |
| rilevamento della morte cellulare in situ, fluoresceina (Roche) | Millipore-Sigma | 11684795910 | |
| bloccante liquido Super PAP PEN, Mini | Fisher Scientific | DAI-PAP-S-M | |
| Carbonato di litio (polvere/certificato ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | L119-500 | 0,5 g/1 L dH2O |
| Siringa Luer-Lok sterile, monouso, 10 mL | VWR | 89215-218-Metanolo | |
| VWR | BDH1135-4LP | ||
| Pharmco Products Alcool etilico, 200 PROOF | Fisher Scientific | ||
| NC1675398-Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Acido acetico ACS Grado | Capitol Scientific | AAP-281000ACSCSLT-Rabbit | |
| anti-Ki67 | BioCare Medical | CRM325 | |
| Richard-Allan Scientific Citoseal XYL Mezzo di montaggio | Fisher Scientific | 22-050-262 | |
| Scientific Industries Incubator-Genie per la cottura di vetrini a 65 gradi | Fisher Scientific | 50-728-103 | |
| Citrato di sodio diidrato | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Kit di dissezione in acciaio inossidabile | VWR | 25640-002 | |
| Superfrost Plus micro vetrini [dimensioni: 25 x 75 x 1 mm] | VWR | 48311-703 | |
| Tamoxifene | Millipore-Sigma | T5648 | 30 mg/mL in olio di mais sterile, preferibilmente fresco o conservazione a breve termine a -20 gradi; C, supporti |
| per 24 vetrini Tissue-Tek sensibili alla luce con manico staccabile | Sakura | 4465 | |
| Tissue-Tek Accu-Edge Lame a basso profilo | Sakura | 4689 | |
| Tissue-Tek Set di colorazione manuale per vetrini | Sakura | 4451 | |
| Piastra per colorazione Tissue-Tek, verde con coperchio | Sakura | 4456 | |
| Piastra per colorazione Tissue-Tek, bianca con coperchio | Sakura | 4457 | |
| Tween 20 | Millipore-Sigma | P7949 | |
| Cassette di elaborazione Unisette | VWR | 87002-292-VWR | |
| Occhiali Micro Cover | VWR | 48393-081 | |
| Xilene | Fisher Scientifico | X5P-1GAL |
Riferimenti
- Helander, H. F., Fandriks, L. Surface area of the digestive tract - Revisited. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 49 (6), 681-689 (2014).
- vander Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithel....
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Ristampe e permessi
