प्रोटोकॉल अवायवीय रूप से सुसंस्कृत मानव योनि बैक्टीरिया के साथ योनि उपनिवेशीकरण का एक माउस मॉडल प्रस्तुत करता है। हम प्रेवोटेला बिविया और फ्यूसोबैक्टीरियम न्यूक्लियेटम के सुझावों को शामिल करते हुए गार्डनरेला वेजाइनिस पर ध्यान केंद्रित करते हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग योनि टीकाकरण और अन्य अवायवीय रूप से उगाए गए बैक्टीरिया की व्यवहार्य वसूली के लिए एक गाइड के रूप में भी किया जा सकता है।
स्तनधारी योनि को कई जीवाणु टैक्सा द्वारा उपनिवेशित किया जा सकता है। मानव योनि माइक्रोबायोम अक्सर लैक्टोबैसिलस प्रजातियों पर हावी होता है, लेकिन चार में से एक महिला बैक्टीरियल वेजिनोसिस का अनुभव करती है, जिसमें लैक्टोबैसिली का निम्न स्तर विविध एनारोबिक बैक्टीरिया के अतिवृद्धि के साथ होता है। यह स्थिति कई स्वास्थ्य जटिलताओं से जुड़ी हुई है, जिसमें प्रजनन और यौन स्वास्थ्य के जोखिम शामिल हैं। जबकि मानव योनि स्वास्थ्य में माइक्रोबियल इंटरैक्शन की जटिल प्रकृति दिखाने वाले सबूत बढ़ रहे हैं, इन विभिन्न एनारोबिक बैक्टीरिया की व्यक्तिगत भूमिकाओं को पूरी तरह से समझा नहीं गया है। यह अवायवीय रूप से उगाए गए योनि बैक्टीरिया का अध्ययन करने के लिए पर्याप्त मॉडल की कमी से जटिल है। माउस मॉडल हमें विवो में इन जीवों के जीव विज्ञान और विषाणु की जांच करने की अनुमति देते हैं। योनि जीवाणु टीकाकरण के अन्य माउस मॉडल पहले वर्णित किए गए हैं। यहां, हम एनारोबिक रूप से उगाए गए बैक्टीरिया के टीकाकरण और पारंपरिक रूप से उठाए गए सी 57 बीएल / 6 चूहों में उनकी व्यवहार्य वसूली के तरीकों का वर्णन करते हैं। योनि टीकाकरण और धोने के लिए एक नई, कम तनावपूर्ण प्रक्रियात्मक विधि भी वर्णित है। गार्डनरेला के टीकाकरण और व्यवहार्य वसूली को विस्तार से रेखांकित किया गया है, और अतिरिक्त एनारोब्स जैसे कि प्रेवोटेला बिविया और फ्यूसोबैक्टीरियम न्यूक्लियेटम के लिए रणनीतियों पर चर्चा की गई है।
स्तनधारियों में, योनि जीवाणु प्रजातियों के एक संघ का घर है। मानव योनि माइक्रोबायोम स्तनधारियों के बीच अद्वितीय है जो जीनस लैक्टोबैसिलस के सदस्यों और संबंधित कम योनि पीएच (3.8-4.5)1,2,3,4 के सदस्यों की बहुतायत में है। इस लैक्टोबैसिलस प्रभुत्व का विघटन विभिन्न प्रकार के नकारात्मक स्वास्थ्य परिणामों से जुड़ा हुआ है।
बैक्टीरियल वेजिनोसिस (बीवी) में कम लैक्टोबैसिली और विविध एनारोबिक बैक्टीरिया की प्रचुरता में वृद्धि होती है, जैसे कि गार्डनरेला वेजाइनिस और प्रेवोटेला बिविया 5,6। बीवी वाली महिलाओं में यौन संचारित संक्रमण 7,8,9, बांझपन 10, गर्भावस्था के नुकसान 11, अपरिपक्व जन्म 12,13,14, अंतर्गर्भाशयी संक्रमण 15, गर्भाशय ग्रीवा संक्रमण16, और कैंसर16,17,18 का खतरा बढ़ जाता है . बीवी संभावित रोगजनक बैक्टीरिया द्वारा योनि उपनिवेशीकरण की उच्च संभावना से भी जुड़ा हुआ है, जैसे कि फ्यूसोबैक्टीरियम न्यूक्लियेटम 1,19,20, एमनियोटिक द्रव संक्रमण21 से एक आम अलगाव।
मानव योनि स्वास्थ्य में एनारोबिक बैक्टीरिया के महत्व के कारण, पशु मॉडल की आवश्यकता है जिसका उपयोग इन जीवों के जीव विज्ञान और रोगजनन की जांच के लिए किया जा सकता है। यहां, हम एस्ट्रोजेनाइज्ड चूहों में योनि टीकाकरण और गार्डनरेला वेजाइनिस की व्यवहार्य वसूली के तरीकों का वर्णन करते हैं और प्रेवोटेला बिविया और फ्यूसोबैक्टीरियम न्यूक्लेटम के लिए अतिरिक्त रणनीतियों का सुझाव देते हैं। मुराइन योनि उपनिवेशीकरण के अन्य मॉडल पहले वर्णित किए गए हैं, लेकिन इनने समूह बी स्ट्रेप्टोकोकस22 और नीसेरिया गोनोरिया23 जैसे संकाय एनारोबिक बैक्टीरिया के टीकाकरण और वसूली पर ध्यान केंद्रित किया है जो एरोबिक रूप से सुसंस्कृत थे। उपयुक्त प्रयोगात्मक रणनीतियों के साथ एनारोबेस का टीकाकरण और वसूली सफलतापूर्वक पूरी की जा सकती है। हम कई बैक्टीरियल टैक्सा की व्यवहार्य वसूली के लिए दृष्टिकोण पर चर्चा करते हैं और अतिरिक्त प्रजातियों / रुचि के उपभेदों की व्यवहार्यता के लिए स्थितियों के अनुभवजन्य मूल्यांकन का सुझाव देते हैं।
जीवित बैक्टीरिया द्वारा उपनिवेशीकरण का अनुमान लगाने की शास्त्रीय विधि कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) की वसूली है। पारंपरिक रूप से उठाए गए चूहों में अपने स्वयं के अंतर्जात माइक्रोबायोटा के साथ, इसके लिए एगर मीडिया पर वसूली की आवश्यकता होती है जो अंतर्जात योनि माइक्रोबायोटा के सदस्यों के खिलाफ चयन करता है, जबकि अभी भी बैक्टीरिया के टीका तनाव को बढ़ने की अनुमति देता है। यहां, हम जी वेजाइनिस24 के एक स्ट्रेप्टोमाइसिन-प्रतिरोधी अलगाव का उपयोग करते हैं जिसे स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त एगर माध्यम पर चुनिंदा रूप से पुनर्प्राप्त किया जा सकता है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि माध्यम पर्याप्त रूप से चयनात्मक है और, इसके विपरीत, कि स्ट्रेप्टोमाइसिन-प्रतिरोधी बैक्टीरिया अंतर्जात माइक्रोबायोम में मौजूद नहीं हैं, टीकाकरण से ठीक पहले एकत्र किए गए योनि लैवेज को चयनात्मक (स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त) एगर पर चढ़ाया जाना चाहिए।
इनोकुलम तैयारी के लिए सबसे अच्छी विधि प्रजातियों और बैक्टीरिया के उपभेदों के बीच भिन्न हो सकती है। चूहों में प्रयोगों की शुरुआत से पहले, प्रारंभिक कार्य संस्कृति माध्यम, विकास समापन बिंदु और इनोकुलम की तैयारी के साथ-साथ पीबीएस में ऑक्सीजन और व्यवहार्यता के लिए संवेदनशीलता के लिए बेहतर परिस्थितियों को निर्धारित करने के लिए किया जाना चाहिए। अधिक ऑक्सीजन-संवेदनशील बैक्टीरिया के मामले में, इनोकुलम की वैकल्पिक तैयारी पर विचार किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, एक उपयुक्त वाहन नियंत्रण समूह के साथ एनारोबिक संस्कृति माध्यम में)25,26।
यहां वर्णित मॉडल पहले प्रकाशित योनि टीकाकरण मॉडल से अलग होने का सबसे महत्वपूर्ण तरीका एनारोबिक रूप से सुसंस्कृत बैक्टीरिया का उपयोग है, जिसे व्यवहार्य इनोकुलम की तैयारी और चूहों से बैक्टीरिया की वसूली के लिए विशेष विचार की आवश्यकता होती है। ऊपर दिए गए प्रोटोकॉल में विशिष्ट कदम उपयोग किए गए बैक्टीरिया की प्रजातियों / तनाव के आधार पर थोड़ा भिन्न हो सकते हैं, जैसा कि पूरक फ़ाइल 1 में सुझाव दिया गया है। इसके अतिरिक्त, यह पांडुलिपि बैक्टीरिया और योनि धोने के प्रशासन के लिए एक नई प्रक्रियात्मक विधि का वर्णन करती है जिसके लिए अन्वेषक की ओर से कम अनुभव और चूहों के लिए कम संयम की आवश्यकता होती है। यदि प्रयोगकर्ता चरण 3.2 में वर्णित संयम के रूप के साथ सहज नहीं है। और चरण 3.3., चूहों को प्रयोगात्मक डिजाइन और संस्थागत आईएसीयूसी दिशानिर्देशों के अनुसार संज्ञाहरण के साथ या बिना पहले वर्णित34 के रूप में वर्णित किया जा सकता है।
मुराइन मॉडल में एनारोबिक रूप से सुसंस्कृत बैक्टीरिया के उपयोग के लिए एक महत्वपूर्ण चेतावनी यह है कि कुछ चरण (जैसे कि जीवित जानवरों को शामिल करना) एनारोबिक कक्ष के बाहर किया जाना चाहिए। इसलिए, इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम वे हैं जिनमें रुचि के बैक्टीरिया को एरोबिक वातावरण के संपर्क में लाया जाएगा, जैसे कि चूहों के टीकाकरण के दौरान। इस मॉडल में किसी भी नए एनारोब के उपयोग के लिए ऑक्सीजन के संपर्क में व्यवहार्यता बनाए रखने की इसकी क्षमता में प्रारंभिक जांच की आवश्यकता होगी (जैसे कि चरण 2.5 और चरण 3.4 में वर्णित पूर्व और बाद के टीकाकरण सीएफयू की तुलना)। जीव की ऑक्सीजन और पीबीएस संवेदनशीलता की डिग्री के आधार पर, इनोकुलम तैयारी के विभिन्न तरीकों पर विचार किया जाना चाहिए (पूरक फ़ाइल 1, चरण 2.4.5.)। वेजाइनिस जेसीपी 8151 बी का उपयोग करके टीकाकरण के लिए, हमने पाया है कि पीबीएस में इनोकुलम की एक ट्यूब तैयार की जा सकती है और सभी चूहों को संक्रमित करने के लिए उपयोग की जा सकती है। यदि एक अलग एनारोबिक जीवाणु का उपयोग किया जा रहा है जो ऑक्सीजन के प्रति अधिक संवेदनशील है, तो इनोकुलम को प्रत्येक माउस के लिए अलग-अलग ट्यूबों में तैयार किया जा सकता है ताकि ट्यूब के बार-बार खुलने / बंद होने की आवश्यकता न हो। इसी तरह, यदि रुचि की जीवाणु प्रजाति जी वेजाइनिस की तुलना में पीबीएस में जीवित रहने में अधिक तेज़ / कम सक्षम है, तो टीकाकरण इसके बजाय संस्कृति मीडिया में तैयार किया जा सकता है। यदि उपयोग किए जाने वाले माध्यम में कम करने वाले एजेंट होते हैं, जैसे कि सीडीसी एनारोब माध्यम जिसका उपयोग प्रेवोटेला बिविया (पूरक फ़ाइल 1, चरण 2.1 और चरण 2.2.) को कल्चर करने के लिए किया जाता है, तो बैक्टीरिया में ऑक्सीजन एक्सपोजर से सुरक्षा भी बढ़ जाएगी।
होमोजेनाइजेशन के वैकल्पिक तरीकों पर भी विचार किया जा सकता है, जैसे कि बीड बीटिंग22,35, जो ट्यूब कैप बंद करके किया जाता है और इसलिए, हैंडहेल्ड होमोजेनाइज़र की तुलना में कम ऑक्सीजन पेश कर सकता है। इसके अतिरिक्त, अधिक ऑक्सीजन-संवेदनशील जीवों को मीडिया के लिए लंबे समय तक संतुलन समय की आवश्यकता हो सकती है। रेसाज़ुरिन जैसे ऑक्सीजन संकेतक का उपयोग यह जांचने के लिए किया जा सकता है कि अवायवीय स्थितियां पहुंच गई हैं (चरण 2.1.)। एनारोबिक जार जैसे वैकल्पिक तरीके परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं और उपयोग से पहले जीवाणु व्यवहार्यता के लिए जांच की जानी चाहिए।
प्रायोगिक जीव की ऑक्सीजन संवेदनशीलता और तेजी भी लैवेज / होमोजेनाइजेशन (पूरक फ़ाइल 1, चरण 3.2 और चरण 5.1.) के दौरान माउस से व्यवहार्य बैक्टीरिया की सफल वसूली में भूमिका निभा सकती है। अत्यधिक संवेदनशील जीवों के लिए, लैवेज लेने और चढ़ाए जाने के बीच का समय व्यवहार्यता का नुकसान कर सकता है और जीवाणु योनि उपनिवेशीकरण का कृत्रिम रूप से कम अनुमान लगा सकता है। इस प्रभाव को कम करने के लिए, एकत्र किए गए लैवेज को तुरंत ताजा एनारोबिक संस्कृति मीडिया (कम करने वाले एजेंट के साथ) में पतला किया जा सकता है। इसी तरह, बैक्टीरिया की व्यवहार्यता बढ़ाने के लिए पीबीएस के बजाय ताजा संस्कृति मीडिया में अंग समरूपीकरण किया जा सकता है और ऑक्सीजन जोखिम को कम करने के लिए एनारोबिक कक्ष में भी किया जा सकता है।
किसी दिए गए प्रयोग के उद्देश्य के आधार पर, प्रयोगकर्ता को नियंत्रण समूहों पर ध्यान देना चाहिए। परिकल्पनाओं का परीक्षण करने के लिए, असंक्रमित नियंत्रण चूहों के आधारभूत उपाय जो अकेले वाहन के साथ नकली इलाज किए जाते हैं, यह स्थापित करने में मदद करेंगे कि क्या केमोकाइन / साइटोकिन्स या संक्रमण के अन्य विशिष्ट परिणामों का प्रेरण है। उपयोग किया जाने वाला नियंत्रण वाहन टीकाकरण के लिए उपयोग किए जाने वाले वाहन के समान होना चाहिए, इसलिए यदि बैक्टीरिया को संस्कृति मीडिया में टीका लगाया जाता है, तो बिना टीकाकरण वाले संस्कृति मीडिया को नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाना चाहिए (पूरक फ़ाइल 1, चरण 2.4.5.)।
इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधियों को एनारोबिक रूप से बढ़ने में सक्षम संकाय बैक्टीरिया पर भी लागू किया जा सकता है, लेकिन पारंपरिक रूप से एरोबिक संस्कृति स्थितियों (जैसे एस्चेरिचिया कोलाई या ग्रुप बी स्ट्रेप्टोकोकस) का उपयोग करके अध्ययन किया जाता है। यह शरीर की साइटों में इन जीवों द्वारा संक्रमण के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक हो सकता है, जिनके बारे में माना जाता है कि गर्भाशय ग्रीवा जैसे ऑक्सीजन का निम्न स्तर होता है। यह हो सकता है कि एक संकाय जीव कम ऑक्सीजन वाले साइटों को अधिक सफलतापूर्वक संक्रमित करता है जब एरोबिक रूप से की तुलना में इनोकुलम को अवायवीय रूप से तैयार किया जाता है। इस तरह के प्रयोग में, सीएफयू गणना के लिए व्यवहार्य बैक्टीरिया की वसूली के लिए एनारोबिक स्थितियों की आवश्यकता नहीं हो सकती है।
The authors have nothing to disclose.
हम इन मॉडलों के विकास के दौरान तकनीकी सहायता के लिए लिन फोस्टर को स्वीकार करते हैं। हम आणविक माइक्रोबायोलॉजी विभाग और महिला संक्रामक रोग अनुसंधान केंद्र (एएल के लिए), और मार्च ऑफ डाइम्स (एएल को बेसिल ओ’कॉनर पुरस्कार) से स्टार्टअप फंड की सराहना करते हैं, जिसने प्रारंभिक चरण के प्रयोगों का समर्थन करने में मदद की। एलर्जी और संक्रामक रोगों के राष्ट्रीय संस्थान (R01 AI114635) ने भी इन मॉडलों के विकास का समर्थन किया।
β-estradiol 17-valerate | Sigma | E1631 | estrogenization of mice |
0.22 µm, 50 mL Steriflip vacuum filter | Fisher | SCGP00525 | sterile filtering sesame oil |
14 mL tube | Falcon | 352059 | estrogenization of mice |
190-proof ethanol | Koptec | V1105M | dissection, tissue homogenization, CDC and Columbia media |
1x PBS | Fisher | MT21040CM | vaginal lavage, G. vaginlalis inoculum prep, tissue collection and homogenization |
25 G × 5/8 -in needle | BD | 305122 | estrogenization of mice |
5 mL tube | Falcon | 352063 | Tissue collection and homogenization |
Anaerobic chamber | Coy | 7200000 | Growth of anaerobic bacteria |
Bacto agar | Fisher | DF0140074 | G. vaginalis, F. nucleatum, and P. bivia agar plates |
Bacto peptone | Fisher | DF0118170 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
Columbia broth | Fisher | DF0944170 | Columbia media for F. nucleatum growth |
Defibrinated sheep blood | Hemostat | DSB500 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | mouse/tissue dissection |
Glucose | Sigma | G7528 | NYCIII media for G. vaginalis growth |
Handheld homogenizer | ISC Bio | 3305500 | Tissue homogenization |
Hemin | Sigma | 51280 | CDC anaerobic media for P. bivia growth, Columbia media for F. nucleatum growth |
HEPES | Cellgro | 25-060-Cl | NYCIII media for G. vaginalis growth |
Horse serum | Hemostat | SHS500 | NYCIII media for G. vaginalis growth |
Hydrogen gas mix (5% hydrogen, 10% CO2, 85% nitrogen) | Matheson | Gas for anaerobic chamber | |
Isofluorane | VetOne | 502017 | mouse anaethesia at sacrifice |
L-cysteine | Sigma | C1276 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
L-glutamate | Sigma | G1626 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
Milli-Q Water Purifier | Millipore | IQ-7000 | for making media and homogenization |
NaCl | Sigma | S3014 | NYCIII media for G. vaginalis growth |
NaOH tablets | Sigma | S5881 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
Nitrogen gas | Airgas | Gas for anaerobic chamber | |
p-200 filter tips | ISC Bio | P-1237-200 | vaginal lavages and bacterial inoculations |
pancreatic digest of casein | Sigma | 70169 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
Proteose peptone #3 | Fisher | DF-122-17-4 | NYCIII media for G. vaginalis growth |
Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | mouse/tissue dissection |
Sesame oil | Fisher | ICN15662191 | estrogenization of mice |
Single edge surgical carbon steel razor blades | VWR | 55411-050 | tissue dissection |
Sodium chloride | Sigma | S3014 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
Spectrophotometer | BioChrom | 80-3000-45 | measuring bacterial OD600 |
Streptomycin | Gibco | 11860038 | add to agar media to make selective plates |
Tuberculin slip tip 1ml syringe | BD | 309659 | estrogenization of mice |
Vitaim K3 | Sigma | M5625 | Columbia media for F. nucleatum growth |
Vitamin K1 | Sigma | 95271 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
Yeast extract | Fisher | DF0127-17-9 | NYCIII media for G. vaginalis growth |