È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
* These authors contributed equally
In questo protocollo, sono stati generati organoidi retinici 3D derivati da cellule staminali pluripotenti (iPSC) di pazienti con retinite pigmentosa. Questi organoidi hanno riassunto con successo alcuni fenotipi clinici della malattia da retinite pigmentosa.
La retinite pigmentosa (RP) è una malattia degenerativa retinica rara ed ereditaria con una prevalenza di circa 1/4.000 persone in tutto il mondo. La maggior parte dei pazienti con RP presenta una progressiva degenerazione dei fotorecettori che porta alla perdita della visione periferica, alla cecità notturna e, infine, alla cecità totale. Ad oggi, sono state riportate migliaia di mutazioni in più di 90 geni associate alla RP. Attualmente, sono disponibili pochi modelli animali per tutti i geni colpiti e per diversi tipi di mutazioni, il che ostacola in gran parte la decifrazione dei meccanismi alla base della patologia genetica/mutazione e limita il trattamento e lo sviluppo di farmaci. Gli organoidi retinici 3D derivati da cellule staminali pluripotenti (iPSC) derivate da pazienti hanno fornito un sistema migliore per modellare la malattia umana ad esordio precoce rispetto alle cellule e agli animali. Al fine di studiare la RP, sono stati utilizzati organoidi retinici 3D derivati da pazienti per ricapitolare i fenotipi clinici della RP. Nelle RO derivate da pazienti RP, l'errata localizzazione della rodopsina era chiaramente mostrata. Rispetto ad altri modelli animali, i modelli di organoidi retinici derivati da iPSC dei pazienti hanno riassunto più fedelmente le caratteristiche della RP e rappresentano un approccio ideale per lo studio della patogenesi della malattia e per lo sviluppo di farmaci.
Le malattie della retina umana, come la retinite pigmentosa e la degenerazione maculare legata all'età, sono scarsamente conosciute a causa della mancanza di modelli sperimentali appropriati 1,2. Sebbene la retina del topo sia molto simile alla retina umana e sia un potente strumento per studiare l'eziologia della degenerazione retinica, ci sono enormi differenze di specie tra topi e esseri umani 3,4. Ad esempio, l'architettura nucleare delle cellule fotorecettrici nei topi e negli esseri umani è diversa e la retina de....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Il protocollo segue le linee guida del comitato etico per la ricerca umana della Capital Medical University.
1. Colture cellulari e generazione di iPSCs
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
L'illustrazione schematica descrive le procedure di differenziazione per generare organoidi retinici sani e pazienti derivati da iPSC (Figura 1). Dalle iPSC alle RO, le variazioni possono essere prodotte a causa di diversi fattori. Lo stato dell'iPSC è il passaggio determinante della generazione RO. Inoltre, si raccomanda vivamente ai ricercatori di registrare ogni fase, catalogo e numero di lotto di tutti i media in modo che l'intero esperimento sia tracciabile. Nella F.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Gli organoidi retinici sono strutture laminate 3D derivate da hiPSC o cellule staminali embrionali (ESC) e rappresentano un modello molto promettente per imitare i modelli spaziali e temporali dello sviluppo retinico umano 31,32. Le RO sono costituite da vari tipi di cellule retiniche, tra cui fotorecettori, cellule bipolari, cellule ganglionari, cellule amacrine, cellule orizzontali e glia di Müller33. La.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Tutti gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Ringraziamo M.S. Yan-ping Li e Zhuo-lin Liu per il loro supporto tecnico e gli utili commenti riguardanti il manoscritto. Questo lavoro è stato in parte sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (82171470, 31871497, 81970838, Z20J00122), dalla Beijing Municipal Natural Science Foundation (Z200014, 82125007) e dal National Key R&D Program of China (2017YFA0105300).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 96 pozzetti conici con fondo a V | Sumitomo bachelite | MS-9096VZ | |
| A-83... 01 | R& D Systems | 2939/10 | |
| Vetrini per microscopio ad adesione | CITOtest | 188105 | |
| Agarose | Gene Tech | 111760 | |
| Amaxa Nucleofector 2b Dispositivo | Lonza | AAB-1001 | Sistema di trasfezione |
| B-27 | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| bFGF | R& D Systems | 3718-FB | |
| Blebbistatin | Nuwacell Biotechnologies | RP01008 | |
| Provetta per prelievo di sangue | BD Vacutainer EDTA | 366643 | |
| CHIR99021 | TOCRIS | 4423/10 | |
| Vetrini di copertura | CITOGLAS | 10212440C | |
| cTarget hPSC Medium | Nuwacell Biotechnologies | RP01020 | |
| DAPI | Invitrogen | D-1306 | |
| DMEM/Ham' s F12 | Gibco | 10565-042 | |
| Asino anti-topo 488 | Invitrogen | A-21202 | |
| Asino anti-coniglio 594 | Invitrogen | A-21207 | |
| EDTA | Nuwacell Biotechnologies | RP01007 | |
| Terreno di inclusione | FluorSaveTM Reagente | 345789 | |
| EX-CYTE terreno di miglioramento della crescita | Sigma | 811292 | Terreno di miglioramento della crescita |
| Siero fetale bovino | Gibco | 04-002-1A | |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | 26873-85-8 | Terreno di gradiente di densità |
| FLT3L | Peprotech | 300-19 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | Integratore di L-glutammina |
| HA-100 | STEMCELL Technologies | 72482 | |
| Prosciutto s F12 | Gibco | 11765-054 | |
| hLIF | Thermo Fisher Scientific | AF-250-NA | |
| Omogeneizzatore | EDEN lab | D-130 | |
| IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| Iscove' s Modified Dulbecco Medium | Gibco | 12440053 | |
| KnockOut Serum Replacement - Multi-Species | Gibco | A3181502 | Terreni di sostituzione del siero |
| L/M-opsina | Millipore | ab5405 | |
| Monotioglicerolo | Sigma | M6145 | |
| N-2 integratore | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Nanodrop Spettrofotometro | Thermo Fisher Scientific | ND2000 | Spettrofotometro |
| ncEpic 125x Supplemento | Nuwacell Biotechnologies | RP01001-02 | 125x |
| Supplemento ncEpic Basal Medium | Nuwacell Biotechnologies | RP01001-01 | Basal hpsc medium |
| ncLaminin511 proteina umana ricombinante | Nuwacell Biotechnologies | RP01025 | |
| PD0325901 | STEMCELL Technologies | 72182 | |
| Penicillina-streptomicina | Gibco | 15140-122 | |
| BMP4 umano ricombinante | R& D Systems | 314-BP | |
| Acido retinoico | Sigma | R2625 | |
| Rodopsina | Sigma | O4886 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| sIL6-R | Thermo Fisher Scientific | RP-75602 | |
| StemSpan SFEM medium | STEMCELL Technologies | 09600 | |
| Taurina | Sigma | T8691 | |
| Reagente Trizol | Invitrogen | 15596026 | |
| Vitronectina | Nuwacell Biotechnologies | RP01002 | |
| Coltello V-Lance | Alcon | Surgical 8065912001 |
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Questo articolo è stato pubblicato
Video in arrivo