Implementering av minimalt invasiv hjernesvulstreseksjon hos gnagere for høy levedyktighetsvevsamling
Summary
Denne protokollen beskriver en standardisert reseksjon av hjernesvulster hos gnagere gjennom en minimal invasiv tilnærming med et integrert vevsbevaringssystem. Denne teknikken har implikasjoner for nøyaktig speiling av omsorgsstandarden i gnagere og andre dyremodeller.
Abstract
Denne protokollen beskriver et standardisert paradigme for reseksjon av hjernesvulst hos gnagere og vevsbevaring. I klinisk praksis er maksimal tumorreseksjon standardbehandling for de fleste hjernesvulster. Imidlertid inkluderer de fleste tilgjengelige prekliniske hjernesvulstmodeller enten ikke reseksjon, eller benytter kirurgiske reseksjonsmodeller som er tidkrevende og fører til signifikant postoperativ morbiditet, dødelighet eller eksperimentell variabilitet. I tillegg kan det være skremmende å utføre reseksjon hos gnagere av flere grunner, inkludert mangel på klinisk sammenlignbare kirurgiske verktøy eller protokoller og fraværet av en etablert plattform for standardisert vevsinnsamling. Denne protokollen fremhever bruken av en multifunksjonell, ikke-ablativ reseksjonsanordning og et integrert vevsbevaringssystem tilpasset den kliniske versjonen av enheten. Enheten som ble brukt i denne studien kombinerer tunable sug og et sylindrisk blad ved blenderåpningen for å nøyaktig sonde, kutte og sugevev. Den minimalt invasive reseksjonsanordningen utfører sine funksjoner via det samme burrhullet som brukes til den første tumorimplantasjonen. Denne tilnærmingen minimerer endringer i regional anatomi under biopsi eller reseksjonsoperasjoner og reduserer risikoen for betydelig blodtap. Disse faktorene reduserte operasjonstiden signifikant (<2 min/dyr), forbedret postoperativ dyreoverlevelse, lavere variabilitet i eksperimentelle grupper og resulterer i høy levedyktighet av resektert vev og celler for fremtidige analyser. Denne prosessen forenkles av en bladhastighet på ~ 1,400 sykluser / min, noe som gjør det mulig å høste vev i et sterilt lukket system som kan fylles med en fysiologisk løsning av valg. Gitt den nye betydningen av å studere og nøyaktig modellere virkningen av kirurgi, bevaring og streng komparativ analyse av regionaliserte tumorreseksjonsprøver og intra-hulromsleverte terapier, vil denne unike protokollen utvide mulighetene for å utforske ubesvarte spørsmål om perioperativ ledelse og terapeutisk oppdagelse for hjernesvulstpasienter.
Introduction
Glioblastom (GBM) er den vanligste og mest aggressive primære hjernesvulsten hos voksne. Til tross for nylige fremskritt innen nevrokirurgi, målrettet medisinutvikling og strålebehandling, er den 5-årige overlevelsesraten for GBM-pasienter mindre enn 5%, en statistikk som ikke har forbedret seg betydelig på over tre tiår1. Derfor er det behov for mer effektive behandlingsstrategier.
For å utvikle nye terapier blir det stadig tydeligere at undersøkelsesprotokoller må (1) bruke oversettbare prekliniske modeller som nøyaktig rekapitulerer tumor heterogenitet og mikromiljø, (2) speile standard terapeutisk regime som brukes hos pasienter med GBM, som for tiden inkluderer kirurgi, strålebehandling og kjemoterapi, og (3) redegjøre for forskjellen mellom resektert kjerne og resterende, invasivt tumorvev 2,3,4,5. Imidlertid implementerer de fleste av de tilgjengelige prekliniske hjernesvulstmodellene enten ikke kirurgisk reseksjon eller bruker kirurgiske reseksjonsmodeller som er relativt tidkrevende, noe som fører til en betydelig mengde blodtap eller mangel på standardisering. Videre kan det være utfordrende å utføre reseksjon av hjernesvulster hos gnagere på grunn av mangel på klinisk sammenlignbare kirurgiske verktøy eller protokoller og fravær av en etablert plattform6 for systematisk vevsinnsamling (tab 1).
Denne protokollen tar sikte på å beskrive et standardisert paradigme for reseksjon av hjernesvulster og vevsbevaring ved hjelp av et multifunksjonelt ikke-ablativt minimalt invasivt reseksjonssystem (MIRS) og et integrert vevsbevaringssystem (TPS) (figur 1). Det forventes at denne unike teknikken vil gi en standardisert plattform som kan brukes i ulike studier i preklinisk forskning for GBM og andre typer hjernesvulstmodeller. Forskere som undersøker terapeutiske eller diagnostiske modaliteter for hjernesvulster, kan implementere denne protokollen for å oppnå en standardisert reseksjon i sine studier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tumorreseksjon er en hjørnestein i nevrokirurgiske onkologiske behandlingsplaner for både lavgradige og høyverdige hjernesvulster. Cytoreduksjon og debulking av svulsten korrelerer med forbedret nevrologisk funksjon og total overlevelse hos pasienter med hjernesvulster 1,2,5,6. Selv om protokoller for kirurgisk reseksjon tidligere er beskrevet i gnagermodeller, har disse protokollene lidd av…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Materials
| 1 mL syringes | BD | 309628 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430052 | |
| 200 proof ethanol | PharmCo | 111000200 | |
| 5 mL pipettes | CoStar | 4487 | |
| 70 micron filter | Fisher | 08-771-2 | |
| Accutase | Millipore Sigma | SIG-SCR005 | |
| Anased (Xylazine injection, 100 mg/mL) | Covetrus | 33198 | |
| Anesthesia System | Patterson Scientific | 78935903 | |
| Anesthesic Gas Waste Container | Patterson Scientific | 78909457 | |
| Bench protector underpad | Covidien | 10328 | |
| C57Bl/6, 6-8 week old mice | Charles River Laboratories | Strain Code 027 | |
| ChroMini Pro | Moser | Type 1591-Q | |
| Collagenase-Dispase | Roche | #10269638001 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher | ||
| Countess II FL Hemacytometer | Thermo Fisher | A25750 | |
| Debris Removal Solution | Miltenyi Biotech | #130-109-398 | |
| D-Luciferin | Goldbio | LUCK-1G | |
| DMEM F12 media | Corning | 10-090-CV | |
| DMEM media | Corning | 10-013-CV | |
| DNAse I | Sigma Aldrich | #10104159001 | |
| Eppendorf tubes | Posi-Click | 1149K01 | |
| Euthanasia solution | Henry Schein | 71073 | |
| FBS | Millipore Sigma | F4135 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10437-028 | |
| Formalin | Invitrogen | INV-28906 | |
| Gauze | Henry Schein | 101-4336 | |
| hEGF | PeproTech EC | 100-15 | |
| Heparin | Sigma | H-3149 | |
| hFGF-b | PeproTech EC | 1001-18B | |
| Induction Chamber | Patterson Scientific | 78933388 | |
| Isoflurane | Covetrus | 11695-6777-2 | |
| Isoflurane Vaporizer | Patterson Scientific | 78916954 | |
| Ketamine | Covetrus | 11695-0703-1 | |
| Kopf Stereotactic frame | Kopf Instruments | 5001 | |
| Lightfield Microscope | BioTek | Cytation 5 | |
| Microinjection Unit | Kopf | 5001 | |
| Micromotor drill | Foredom | F210418 | |
| MRI system | Bruker | 7T Biospec Avance III MRI Scanner | |
| NICO Myriad System | NICO Corporation | ||
| Ophthalmic ointment | Puralube vet ointment | ||
| Papain | Sigma Aldrich | #P4762 | |
| PBS | Invitrogen | #14190250 | |
| PenStrep | Millipore Sigma | N1638 | |
| Percoll solution | Sigma Aldrich | #P4937 | |
| Pipette controller | Falcon | A07260 | |
| Povidone-iodine solution | Aplicare | 52380-1905-08 | |
| Progesterone | Sigma | P-8783 | |
| Putrescine | Sigma | P-5780 | |
| RPMI Media | Invitrogen | INV-72400120 | |
| Scalpel blade | Covetrus | 7319 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Skin marker | Time Out | D538,851 | |
| Staple remover | MikRon | ACR9MM | |
| Stapler | MikRon | ACA9MM | |
| Staples | Clay Adams | 427631 | |
| Stereotactic Frame | Kopf Instruments | 5000 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Suture, vicryl 4-0 | Ethicon | J494H | |
| T-75 culture flask | Sarstedt | 83-3911-002 | |
| TheraPEAKTM ACK Lysing Buffer (1x) | Lonza | BP10-548E | |
| Trypsin-EDTA | Corning | MDT-25-053-CI |
Riferimenti
- Mineo, J. F., et al. Prognosis factors of survival time in patients with glioblastoma multiforme: a multivariate analysis of 340 patients. Acta Neurochirurgica. 149 (3), 245-252 (2007).
- Miyai, M., et al. Current trends in mouse models of glioblastoma. Journal of Neuro-Oncology. 135 (3), 423-432 (2017).
- Raj, D., Agrawal, P., Gaitsch, H., Wicks, E., Tyler, B. Pharmacological strategies for improving the prognosis of glioblastoma. Expert Opinion on Pharmacotherapy. 22 (15), 2019-2031 (2021).
- Alomari, S., et al. Drug repurposing for Glioblastoma and current advances in drug delivery-a comprehensive review of the literature. Biomolecules. 11 (12), 1870 (2021).
- Serra, R., et al. Combined intracranial Acriflavine, temozolomide and radiation extends survival in a rat glioma model. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics : Official Journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik eV. 170, 179-186 (2022).
- Tang, B., Foss, K., Lichtor, T., Phillips, H., Roy, E. Resection of orthotopic murine brain glioma. Neuroimmunology and Neuroinflammation. 8 (1), 64-69 (2021).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments. (41), e1986 (2010).
- Poussard, A., et al. In vivo imaging systems (IVIS) detection of a neuro-invasive encephalitic virus. Journal of Visualized Experiments. (70), e4429 (2012).
- Lachin, J. M. Nonparametric statistical analysis. JAMA. 323 (20), 2080-2081 (2020).
- Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods. Methods in Molecular Biology. 740, 7-12 (2011).
- Spina, R., Voss, D. M., Asnaghi, L., Sloan, A., Bar, E. E. Flow cytometry-based drug screening system for the identification of small molecules that promote cellular differentiation of Glioblastoma stem cells. Journal of Visualized Experiments. (131), e56176 (2018).
- Rodgers, G., et al. Virtual histology of an entire mouse brain from formalin fixation to paraffin embedding. Part 2: Volumetric strain fields and local contrast changes. Journal of Neuroscience Methods. 365, 109385 (2022).
- Connolly, N. P., et al. Elevated fibroblast growth factor-inducible 14 expression transforms proneural-like gliomas into more aggressive and lethal brain cancer. GLIA. 69 (9), 2199-2214 (2021).
- Stall, B., et al. Comparison of T2 and FLAIR imaging for target delineation in high grade gliomas. Radiation Oncology. 5, 5 (2010).
- Das, A., et al. Establishing a standardized method for the effective intraoperative collection and biological preservation of brain tumor tissue samples using a novel tissue preservation system: a pilot study. World Neurosurgery. , (2022).
- Zusman, E., et al. Tissues harvested using an automated surgical approach confirm molecular heterogeneity of Glioblastoma and enhance specimen’s translational research value. Frontiers in Oncology. 9, (2019).
- McLaughlin, N., et al. Side-cutting aspiration device for endoscopic and microscopic tumor removal. Journal of Neurological Surgery Part B. 73 (1), 11-20 (2012).
