Det strukturella ensemblet av monomer alfa-synuklein påverkar dess fysiologiska funktion och fysikalisk-kemiska egenskaper. Detta protokoll beskriver hur man utför millisekundväte / deuteriumutbytesmasspektrometri och efterföljande dataanalyser för att bestämma konformationsinformationen om monomeren av detta inneboende oordnade protein under fysiologiska förhållanden.
Alfa-synuklein (aSyn) är ett inneboende oordnat protein vars fibrillära aggregat är rikliga i Lewy-kroppar och neuriter, som är kännetecknen för Parkinsons sjukdom. Ändå involverar mycket av dess biologiska aktivitet, liksom dess aggregering, centralt den lösliga monomerformen av proteinet. Belysning av de molekylära mekanismerna i aSynbiologi och patofysiologi kräver strukturellt högt upplösta metoder och är känslig för biologiska förhållanden. Dess naturligt utfällda, metastabila strukturer gör monomer aSyn svårhanterlig för många strukturbiologiska tekniker. Här beskrivs tillämpningen av ett sådant tillvägagångssätt: väte/ deuteriumutbytesmasspektrometri (HDX-MS) på millisekundens tidsskala för studier av proteiner med låg termodynamisk stabilitet och svaga skyddsfaktorer, såsom aSyn. Vid millisekundens tidsskala innehåller HDX-MS-data information om lösningsmedelstillgänglighet och vätebunden struktur hos aSyn, som går förlorad vid längre märkningstider, vilket i slutändan ger strukturell upplösning upp till aminosyranivån. Därför kan HDX-MS ge information vid höga strukturella och tidsmässiga upplösningar om konformationsdynamik och termodynamik, intra- och intermolekylära interaktioner och de strukturella effekterna av mutationer eller förändringar i miljöförhållandena. Även om det är allmänt tillämpligt visas det hur man förvärvar, analyserar och tolkar millisekunder HDX-MS-mätningar i monomer aSyn.
Parkinsons sjukdom (PD) är en neurodegenerativ sjukdom som drabbar miljontals människor världen över1. Det kännetecknas av bildandet av cytoplasmatiska inklusioner som kallas Lewy-kroppar och Lewy-neuriter i hjärnans substantia nigra pars compacta-region. Dessa cytoplasmatiska inklusioner har visat sig innehålla aggregat av det inneboende oordnade proteinet aSyn2. Vid PD och andra synucleinopatier omvandlas aSyn från ett lösligt oordnat tillstånd till ett olösligt, mycket strukturerat sjukt tillstånd. I sin ursprungliga form antar monomer aSyn ett brett spektrum av konformationer stabiliserade av långväga elektrostatiska interaktioner mellan dess N- och C-termini och hydrofoba interaktioner mellan dess C-terminus och icke-amyloid beta-komponent (NAC) region 3,4,5,6. Eventuella störningar i dessa stabiliserande interaktioner, såsom mutationer, post-translationella modifieringar och förändringar i den lokala miljön, kan leda till felveckning av monomeren, vilket utlöser aggregeringsprocessen7.
Medan det finns en stor mängd forskning om oligomera och fibrillära former av aSyn 8,9,10,11, finns det ett avgörande behov av att studera proteinets monomera form och bättre förstå vilka konformatorer som är funktionella (och hur) och vilka som är benägna att aggregera 8,9,10,11 . Att vara inneboende oordnad, endast 14 kDa i storlek och svår att kristallisera, är aSyn-monomeren inte mottaglig för de flesta strukturella biologiska tekniker. En teknik som kan mäta konformationsdynamiken hos monomer aSyn är dock millisekund HDX-MS, som nyligen har genererat viktiga strukturella observationer som annars skulle vara utmanande eller omöjliga att få 12,13,14. Millisekund HDX-MS mäter känsligt medelvärdet av proteinkonformationsensemblen genom att övervaka isotoputbytet vid amidväteer, vilket indikerar lösningsmedelstillgänglighet och vätebindningsnätverksdeltagande för en viss proteinregion på millisekundtidsskalan. Det är nödvändigt att betona millisekundaspekten av HDX-MS eftersom aSyn på grund av sin naturligt utvecklade, metastabila natur uppvisar mycket snabb väteutbyteskinetik som manifesterar sig långt under den nedre gränsen för konventionella HDX-MS-system. Till exempel har det mesta av aSyn-molekylen helt bytt ut väte mot deuterium under intracellulära förhållanden på mindre än 1 s. Flera laboratorier har nu byggt snabbblandande instrument; i detta fall används ett prototyp snabbt mixande släckflödesinstrument som kan utföra HDX-MS med en dödtid på 50 ms och en tidsupplösning på 1 ms15. Medan millisekund HDX-MS nyligen har varit akut viktigt i studien av aSyn, står det att vara värdefullt för att studera inneboende oordnade proteiner / regioner i större utsträckning och ett stort antal proteiner med loopar / regioner som bara är svagt stabila. Till exempel peptidläkemedel (t.ex. insulin; GLP-1/glukagon; tirzepatid) och peptidfusionsproteiner (t.ex. HIV-hämmaren FN3-L35-T1144) är viktiga läkemedelsformat där struktur- och stabilitetsinformation i lösningsfasen kan vara en kritisk ingång för beslut om läkemedelsutveckling, och ändå är peptiddelen ofta bara svagt stabil och svårhanterlig av HDX-MS vid sekundernas tidsskala 16,17,18,19,20 . Emergent HDX-MS-metoder med märkning i sekunder/minuter-domänerna har visat sig härleda strukturell information för DNA G-quadruplexer, men det bör vara möjligt att utvidga detta till mer olika oligonukleotidstrukturer genom tillämpning av millisekund HDX-MS21.
HDX-MS-experiment kan utföras på tre olika nivåer: (1) bottom-up (varigenom det märkta proteinet smälts proteolytiskt), (2) middle-down (där det märkta proteinet smälts proteolytiskt och de resulterande peptiderna fragmenteras ytterligare genom mjukfragmenteringstekniker), och (3) top-down (där mjukfragmenteringstekniker direkt fragmenterar det märkta proteinet)22 . Således tillåter submolekylära HDX-MS-data oss att lokalisera utbytesbeteendet till specifika regioner i ett protein, vilket gör det kritiskt att ha tillräcklig sekvenstäckning för sådana experiment. Den strukturella upplösningen för alla HDX-MS-experiment beror på antalet proteolytiska peptider eller fragment härledda från proteinet vid matsmältning respektive mjukfragmentering. I var och en av de tre experimenttyperna som beskrivs ovan mappas förändringen i amidutbyte vid varje peptid / fragment tillbaka på proteinets primära struktur för att indikera beteendet hos lokaliserade regioner i proteinet. Medan den högsta strukturella upplösningen uppnås genom mjuk fragmentering, är beskrivningen av dessa experiment utanför ramen för den aktuella studien, som fokuserar på mätning av aSyn-monomerkonformationer. Utmärkta resultat kan erhållas med det vanliga “bottom-up” -arbetsflödet som beskrivs här.
Här tillhandahålls procedurer för (1) hur man förbereder och hanterar aSyn-prover och HDX-MS-buffertar, (2) hur man utför peptidkartläggning för ett HDX-MS-experiment underifrån, (3) hur man förvärvar HDX-MS-data på monomer aSyn under fysiologiska förhållanden, särskilt i millisekundtidsdomänen (med hjälp av ett specialbyggt instrument; alternativa instrument för millisekundmärkning har också beskrivits), och (4) hur man bearbetar och analyserar HDX-MS-data. Metoder som använder monomer aSyn vid fysiologiskt pH (7,40) i två lösningsförhållanden exemplifieras här. Även om de är kritiskt användbara i studien av aSyn, kan dessa procedurer tillämpas på vilket protein som helst och är inte begränsade till inneboende oordnade proteiner.
I den här artikeln beskrivs följande procedurer: (1) utföra peptidkartläggningsexperiment på monomer aSyn för att erhålla den högsta sekvenstäckningen, (2) förvärva millisekund HDX-MS-data på monomer aSyn under fysiologiska förhållanden och (3) utföra dataanalys och tolkning av de resulterande HDX-MS-data. De angivna procedurerna är i allmänhet enkla att utföra, varje märkningsexperiment varar vanligtvis bara cirka 8 timmar för tre replikat och åtta tidpunkter, och kartläggningsexperimentet varar ba…
The authors have nothing to disclose.
NS finansieras av Universitetsrådets Diamantjubileumsstipendium. JJP stöds av ett UKRI Future Leaders Fellowship [Bidragsnummer: MR/T02223X/1].
1 × 100 mm ACQUITY BEH 1.7 μm C18 column | Waters Corporation | 186002346 | Analytical column |
Acetonitrile HPLC grade >99.9% HiPerSolv | VWR | 20060.420 | For LC mobile phases |
CaCl2 | Sigma Aldrich | C5670 | Salt for HDX buffers |
Chronos | Axel Semrau (Purchased from Waters Corporation) | 667006090 | Scheduling software to enable multiple HDX-MS sample injections automatically. Alternative software is available from other vendors e.g. HDXDirector or LEAP Shell |
Deuterium chloride | Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) | DLM-2-50 | For HDX labelling buffers |
Deuterium oxide (99.9% D2O) | Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) | DLM-4 | Deuterated water |
DynamX 3.0 | Waters Corporation | 176016027 | Isotopic assignment and deuterium incorporation calculation |
Enzymate BEH Pepsin Column | Waters Corporation | 186007233 | Pepsin digestion column |
Formic Acid, 99.0% LC/MS Grade | Fisher Scientific | 10596814 | For LC mobile phases |
Guanidinium hydrochloride | Sigma Aldrich | RDD001-500G | Chaotrope/Denaturant |
HDfleX | University of Exeter | N/A | https://ore.exeter.ac.uk/repository/handle/10871/127982 |
KCl | Sigma Aldrich | P3911 | Salt for HDX buffers |
LEAP HDX-2 CTC PAL sampling robot | Waters Corporation | 725000637 | Autosampler robot |
Leucine enkephalin | Waters Corporation | 186006013 | For mass spectrometry lockspray calibration. |
MassLynx | Waters Corporation | 667004007 | Software controlling inlet methods and mass spectrometer |
Maximum recovery vials | Waters Corporation | 600000670CV | 100 pack including caps – used for quench tray in LEAP HDX-2 |
MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | Salt for HDX buffers |
Millipore 0.22 µm syringe filters | Millipore | N9CA7069B | Syringe filters |
ms2min | Applied Photophysics Ltd | N/A | fast-mix quench-flow millisecond hdx instrument |
NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | Salt for HDX buffers |
Peltier temperature controller | LEAP Technologies Inc. | HP115-COOL/D | Peltier controller to set precise temperature of chambers in the LEAP robot. |
ProteinLynx Global Server 3.0 | Waters Corporation | 715001030 | Peptide identification software. Alternative software is available from other vendors. |
Reagent pot caps | Waters Corporation | 186004632 | 100 pack |
Reagent pots for LEAP HDX-2 | Waters Corporation | 186001420 | 100 pack excluding caps – used for buffers in LEAP HDX-2 |
Sodium deuteroxide (99.5% in D2O) | Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) | DLM-57 | For HDX labelling buffers |
Spin filter microcentrifuge tubes (3 kDa MWCO) | Amicon (Merck Sigma Aldrich) | UFC5003 | Micro centrifuge tubes to concentrate protein. This facilitates buffer exchange and accurate sample loading for HDX-MS experiments. |
Synapt G2-Si mass spectrometer | Waters Corporation | 176850035 | Mass spectrometer |
Total recovery vials | Waters Corporation | 600000671CV | 100 pack including caps – used for labelling tray in LEAP HDX-2 |
Tris-HCl | Sigma Aldrich | T3253-250G | Buffer |
Trizma base | Sigma Aldrich | T60040-B2005 | Buffer |
Urea | Sigma Aldrich | U5378-1KG | Chaotrope/Denaturant |
VanGuard 2.1 x 5 mm ACQUITY BEH C18 column | Waters Corporation | 186004623 | Trap desalting column |