L'insieme strutturale dell'alfa-sinucleina monomerica influenza la sua funzione fisiologica e le proprietà fisico-chimiche. Il presente protocollo descrive come eseguire la spettrometria di massa a scambio idrogeno/deuterio al millisecondo e le successive analisi dei dati per determinare le informazioni conformazionali sul monomero di questa proteina intrinsecamente disordinata in condizioni fisiologiche.
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Articolo metodologico
Spettrometria di massa a scambio idrogeno/deuterio al millisecondo per lo studio della dinamica strutturale dell'alfa-sinucleina in condizioni fisiologiche
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'alfa-sinucleina (aSyn) è una proteina intrinsecamente disordinata i cui aggregati fibrillari sono abbondanti nei corpi di Lewy e nei neuriti, che sono i segni distintivi della malattia di Parkinson. Tuttavia, gran parte della sua attività biologica, così come la sua aggregazione, coinvolge centralmente la forma monomerica solubile della proteina. La delucidazione dei meccanismi molecolari di aSyn biologia e fisiopatologia richiede metodi strutturalmente altamente risolti ed è sensibile alle condizioni biologiche. Le sue strutture meta-stabili dispiegate nativamente rendono l'aSyn monomerico intrattabile a molte tecniche di biologia strutturale. Qui, viene descritta l'applicazione di uno di questi approcci: spettrometria di massa a scambio idrogeno/deuterio (HDX-MS) sulla scala temporale al millisecondo per lo studio di proteine con bassa stabilità termodinamica e deboli fattori di protezione, come aSyn. Alla scala temporale del millisecondo, i dati HDX-MS contengono informazioni sull'accessibilità al solvente e sulla struttura legata all'idrogeno di aSyn, che vengono perse a tempi di etichettatura più lunghi, producendo in definitiva una risoluzione strutturale fino al livello di amminoacidi. Pertanto, HDX-MS può fornire informazioni ad alte risoluzioni strutturali e temporali sulla dinamica conformazionale e la termodinamica, le interazioni intra e intermolecolari e l'impatto strutturale di mutazioni o alterazioni delle condizioni ambientali. Sebbene ampiamente applicabile, è dimostrato come acquisire, analizzare e interpretare misurazioni HDX-MS al millisecondo in aSyn monomerico.
Introduzione
Il morbo di Parkinson (PD) è una malattia neurodegenerativa che colpisce milioni di persone in tutto il mondo1. È caratterizzato dalla formazione di inclusioni citoplasmatiche note come corpi di Lewy e neuriti di Lewy nella regione della substantia nigra pars compacta del cervello. Queste inclusioni citoplasmatiche sono state trovate per contenere aggregati della proteina intrinsecamente disordinata aSyn2. Nel PD e in altre sinucleinopatie, aSyn si trasforma da uno stato disordinato solubile in uno stato malato insolubile e altamente strutturato. Nella sua forma nativa, l'aSyn monomerico adotta una vasta gamma di conform....
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Protocollo
1. Espressione proteica e purificazione di aSyn
- Preparare aSyn seguendo un report pubblicato in precedenza9.
- Dializzare in un tampone di conservazione sicuro (ad esempio, Tris, pH 7,2 ).
- Se necessario, concentrare il campione (ad esempio, tubi microcentrifuga con filtro spin utilizzando 3 kDa MWCO, 14.000 x g per circa 10-30 minuti, vedere Tabella dei materiali).
NOTA: Si consiglia di non concentrarsi eccessivamente. L'integrità dell'insieme monomerico non è stata verificata oltre i 25 μM. - Aliquota e conservazione a -80 °C
NOTA: La proteina monomerica aSyn ....
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Risultati
A causa della sua natura intrinsecamente disordinata, è difficile catturare gli intricati cambiamenti strutturali in aSyn a pH fisiologico. HDX-MS monitora lo scambio isotopico a idrogeno ammidico della spina dorsale, sondando le dinamiche e le interazioni conformazionali delle proteine. È una delle poche tecniche per acquisire queste informazioni ad alte risoluzioni strutturali e temporali. Questo protocollo è ampiamente applicabile a una vasta gamma di proteine e condizioni tampone, e questo è esemplificato dalla misur.......
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Discussione
Nel presente articolo vengono descritte le seguenti procedure: (1) esecuzione di esperimenti di mappatura peptidica su aSyn monomerico per ottenere la massima copertura di sequenza, (2) acquisizione di dati HDX-MS millisecondi su aSyn monomerico in condizioni fisiologiche e (3) esecuzione di analisi dei dati e interpretazione dei dati HDX-MS risultanti. Le procedure fornite sono generalmente semplici da eseguire, ogni esperimento di etichettatura dura in genere solo circa 8 ore per tre repliche e otto punti temporali e l.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Ringraziamenti
NS è finanziato dalla borsa di studio Diamond Jubilee del Consiglio universitario. JJP è supportato da una UKRI Future Leaders Fellowship [Numero di sovvenzione: MR/T02223X/1].
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1 &volte; 100 mm ACQUITY BEH 1.7 μ m Colonna C18 | Waters Corporation | 186002346 | Colonna analitica |
| Acetonitrile HPLC grado >99,9% HiPerSolv | VWR | 20060.420 | Per fasi mobili LC |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C5670 | Sale per tamponi HDX |
| Chronos | Axel Semrau (Acquistato da Waters Corporation) | 667006090 | Software di pianificazione per abilitare automaticamente più iniezioni di campioni HDX-MS. Il software alternativo è disponibile presso altri fornitori, ad esempio HDXDirector o LEAP Shell |
| Cloruro di deuterio | , Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) | DLM-2-50 | Per tamponi di marcatura HDX, |
| Ossido di deuterio (99,9% D2O) | Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) | DLM-4 | Acqua deuterata |
| DynamX 3.0 | Waters Corporation | 176016027 | Assegnazione isotopica e calcolo dell'incorporazione del deuterio |
| Colonna di pepsina BEH Colonna di pepsina | Waters Corporation | 186007233 | Colonna di digestione della pepsina |
| Acido formico, 99,0% di grado LC/MS | Fisher Scientific 10596814 | Per le fasi mobili LC | |
| Guanidinium cloridrato | Sigma Aldrich | RDD001-500G | Chaotrope/Denaturante |
| HDfleX | Università di Exeter | N/A | https://ore.exeter.ac.uk/repository/handle/10871/127982 |
| KCl | Sigma Aldrich | P3911 | Sale per tamponi HDX |
| LEAP HDX-2 CTC PAL robot di campionamento | Waters Corporation | 725000637 | Robot autocampionatore |
| Leucina encefalina | Waters Corporation | 186006013 | Per la calibrazione lockspray della spettrometria di massa. |
| MassLynx | Waters Corporation | 667004007 | Software di controllo dei metodi di ingresso e spettrometro |
| di massa Fiale di recupero massimo | Waters Corporation | 600000670CV | Confezione da 100 con tappi - utilizzati per il vassoio di tempra in LEAP HDX-2 |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | Sale per tamponi HDX |
| Millipore 0.22 µ m filtri per siringhe | Millipore | N9CA7069B | Filtri per siringhe |
| ms2min | Applied Photophysics Ltd | N/A | hdx al millisecondo a miscelazione rapida |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | Sale per tamponi HDX |
| Regolatore di temperatura Peltier | LEAP Technologies Inc. | HP115-COOL/D | Controllore Peltier per impostare con precisione la temperatura delle camere nel robot LEAP. |
| ProteinLynx Global Server 3.0 | Waters Corporation | 715001030 | Software di identificazione dei peptidi. Il software alternativo è disponibile presso altri fornitori. |
| Tappi per reagenti | Waters Corporation | 186004632 | confezione da 100 |
| vaschette per reagenti per LEAP HDX-2 | Waters Corporation | 186001420 | confezione da 100 esclusi tappi - utilizzati per tamponi in LEAP HDX-2 |
| Deuterossido di sodio (99,5% in D2O) | Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) | DLM-57 | Per tamponi per marcatura HDX Provette |
| microcentrifuga con filtro centrifugo (3 kDa MWCO) | Amicon (Merck Sigma Aldrich) | UFC5003 | Micro provette da centrifuga per concentrare le proteine. Ciò facilita lo scambio del tampone e il caricamento accurato del campione per gli esperimenti HDX-MS. |
| Spettrometro di massa Synapt G2-Si | Waters Corporation | 176850035 | Spettrometro di massa |
| Fiale a recupero totale | Waters Corporation | 600000671CV | Confezione da 100 con tappi - utilizzati per l'etichettatura del vassoio in LEAP HDX-2 |
| Tris-HCl Sigma | Aldrich | T3253-250G | Buffer |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T60040-B2005 | Buffer |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378-1KG | Chaotrope/Denaturante |
| VanGuard 2,1 x 5 mm ACQUITY BEH C18 colonna | Waters Corporation | 186004623 | Colonna di desalinizzazione Trap |
Riferimenti
- Dorsey, E. R., et al. regional, and national burden of Parkinson's disease, 1990-2016: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet Neurology. 17 (11), 939-953 (2018).
- Breydo, L., Wu, J. W., Uversky, V. N.
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Ristampe e permessi
