تحضير جسيمات النواة النيوكليوسوم المعقدة مع عوامل إصلاح الحمض النووي للتحديد الهيكلي للمجهر الإلكتروني بالتبريد
Summary
يحدد هذا البروتوكول بالتفصيل تحضير معقدات النيوكليوسومال باستخدام طريقتين لإعداد العينة لتجميد شبكات TEM.
Abstract
إصلاح الحمض النووي في سياق الكروماتين غير مفهوم بشكل جيد. تظهر الدراسات الكيميائية الحيوية التي تستخدم جزيئات النيوكليوسوم الأساسية ، وهي الوحدة الأساسية المتكررة للكروماتين ، أن معظم إنزيمات إصلاح الحمض النووي تزيل تلف الحمض النووي بمعدلات منخفضة مقارنة بالحمض النووي الحر. لم يتم توضيح التفاصيل الجزيئية حول كيفية تعرف إنزيمات إصلاح استئصال القاعدة (BER) على تلف الحمض النووي في النيوكليوسومات وإزالته. ومع ذلك ، تشير بيانات BER البيوكيميائية للركائز النووية إلى أن النيوكليوسوم يقدم حواجز هيكلية مختلفة تعتمد على موقع آفة الحمض النووي والإنزيم. وهذا يشير إلى أن الآليات التي تستخدمها هذه الإنزيمات لإزالة تلف الحمض النووي (DNA) في الحمض النووي الحر قد تختلف عن الآليات المستخدمة في النيوكليوسومات. بالنظر إلى أن غالبية الحمض النووي الجينومي يتم تجميعها في النيوكليوسومات ، فإن المعلومات التركيبية لهذه المركبات مطلوبة. حتى الآن ، يفتقر المجتمع العلمي إلى بروتوكولات مفصلة لإجراء دراسات هيكلية مجدية تقنيا لهذه المجمعات. هنا ، نقدم طريقتين لإعداد مركب من اثنين من إنزيمات BER المنصهرة وراثيا (Polymerase β و AP Endonuclease1) مرتبطة بفجوة نيوكليوتيد واحدة بالقرب من دخول وخروج النيوكليوسوم للمجهر الإلكتروني بالتبريد (cryo-EM) التحديد الهيكلي. كلتا الطريقتين لتحضير العينة متوافقتان مع شبكات جودة التزجيج عن طريق التجميد الغاطس. يمكن استخدام هذا البروتوكول كنقطة انطلاق لإعداد معقدات نووية أخرى بعوامل BER مختلفة ، وعوامل نسخ رائدة ، وإنزيمات معدلة للكروماتين.
Introduction
يتم تنظيم الحمض النووي حقيقي النواة وضغطه بواسطة بروتينات هيستون ، مكونا الكروماتين. يشكل جسيم النواة الأساسي (NCP) الوحدة الأساسية المتكررة للكروماتين التي تنظم إمكانية الوصول إلى البروتينات المرتبطة بالحمض النووي لإصلاح الحمض النووي ونسخه وتكراره1. على الرغم من أن البنية البلورية الأولى للأشعة السينية ل NCP قد تم حلها لأول مرة منذ أكثر من عقدين منالزمن 2 وتم نشر العديد من هياكل NCP منذ3،4،5،6 ، لم يتم بعد تحديد آليات إصلاح الحمض النووي في الركائز النووية. سيتطلب الكشف عن التفاصيل الجزيئية الكامنة وراء إصلاح الحمض النووي في الكروماتين توصيفا هيكليا للمكونات المشاركة لفهم كيفية تنظيم السمات الهيكلية المحلية ل NCP لأنشطة إصلاح الحمض النووي. هذا مهم بشكل خاص في سياق إصلاح استئصال القاعدة (BER) بالنظر إلى أن الدراسات الكيميائية الحيوية مع إنزيمات BER تشير إلى آليات فريدة لإصلاح الحمض النووي في النيوكليوسومات التي تعتمد على المتطلبات الهيكلية الخاصة بالإنزيم للتحفيز والموقع الهيكلي لآفة الحمض النووي داخل النيوكليوسوم7،8،9،10،11،12،13 . بالنظر إلى أن BER هي عملية إصلاح حيوية للحمض النووي ، فهناك اهتمام كبير بسد هذه الفجوات مع إنشاء نقطة انطلاق يمكن من خلالها إجراء دراسات هيكلية أخرى مجدية تقنيا تتضمن مجمعات نيوكليوسومات ذات صلة.
أصبح Cryo-EM بسرعة الطريقة المفضلة لحل البنية ثلاثية الأبعاد (3D) للمجمعات التي يمثل إعدادها على نطاق واسع لعينة متجانسة تحديا. على الرغم من أن تصميم وتنقية NCPs المعقدة بعامل إصلاح الحمض النووي (NCP-DRF) سيتطلب على الأرجح تحسينا مخصصا ، فإن الإجراء المقدم هنا لتوليد وتجميد مجمع NCP-DRF مستقر يوفر تفاصيل حول كيفية تحسين العينة وإعداد شبكة cryo-EM. هناك سير عمل (غير متعارضين) موضحين في الشكل 1 ، والتفاصيل المحددة في البروتوكول تحدد الخطوات الهامة وتوفر استراتيجيات لتحسين هذه الخطوات. سيدفع هذا العمل مجال إصلاح الكروماتين والحمض النووي في اتجاه يصبح فيه استكمال الكيمياء الحيوية بالدراسات الهيكلية ممكنا تقنيا لفهم الآليات الجزيئية لإصلاح الحمض النووي النووي بشكل أفضل.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعتمد بروتوكول محدد لتنقية عامل إصلاح الحمض النووي على الإنزيم محل الاهتمام. ومع ذلك ، هناك بعض التوصيات العامة ، بما في ذلك استخدام الطرق المؤتلفة للتعبير عن البروتين وتنقيته18 ؛ إذا كان البروتين محل الاهتمام صغيرا جدا (<50 كيلو دالتون) ، فإن تحديد الهيكل بواسطة cryo-EM كان شبه مست…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور ماريو بورجنيا من نواة cryo-EM في المعهد الوطني لعلوم الصحة البيئية والدكتور جوشوا شتراوس من جامعة نورث كارولينا في تشابل هيل على إرشادهم وتدريبهم في إعداد شبكة cryo-EM. كما نشكر الدكتورة جوليانا ميلو دا فونسيكا ريزيندي على المساعدة التقنية في المراحل الأولية من هذا المشروع. نحن نقدر المساهمة والدعم الرئيسيين للراحل الدكتور صموئيل ويلسون وأعضاء مختبره ، وخاصة الدكتور راجندرا براساد والدكتور جوناس جامسن لتنقية مركب APE1-Polβ المنصهر وراثيا. تم دعم البحث من قبل برنامج البحوث الداخلية للمعاهد الوطنية للصحة ، والمعهد الوطني لعلوم الصحة البيئية [أرقام المنح Z01ES050158 و Z01ES050159 و K99ES031662-01].
Materials
| 1 M HEPES; pH 7.5 | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| 1 M MgCl2 | Thermo Fisher Scientific | AM9530G | |
| 10x TBE | Bio-rad | 1610733 | |
| 25% glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| 3 M KCl | Thermo Fisher Scientific | 043398.K2 | |
| 491 prep cell | Bio-rad | 1702926 | |
| Amicon Ultra 15 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) | Millipore Sigma | Z717185 | |
| Amicon Ultra 4 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) | Millipore Sigma | UFC8030 | |
| AutoGrid Tweezers | Ted Pella | 47000-600 | |
| Automatic Plunge Freezer | Leica | Leica EM GP | |
| C-1000 touch thermocycler | Bio-rad | 1851148 | |
| C-clips and rings | Thermo Fisher | 6640–6640 | |
| Clipping station | SubAngostrom | SCT08 | |
| Dialysis Membrane (MW cufoff 6-8 kDa) | Fisher Scientific | 15370752 | |
| Diamond Tweezers | Techni-Pro | 758TW0010 | |
| dsDNA | Integrated DNA techonologies | N/A | |
| FEI Titan Krios | Thermo Fisher | KRIOSG4TEM | |
| FPLC purification system | AKTA Pure | 29018224 | |
| Fraction collector Model 2110 | Bio-rad | 7318122 | |
| Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella | 91000S | |
| Grid Boxes | SubAngostrom | PB-E | |
| Grid Storage Accessory Pack | SubAngostrom | GSAX | |
| Liquid Ethane | N/A | N/A | |
| Liquid Nitrogen | N/A | N/A | |
| Minipuls 3 peristaltic two-head pump | Gilson | F155008 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| Novex 16%, Tricine, 1.0 mm, Mini Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | EC6695BOX | |
| Pipetman | Gilson | FA10002M | |
| Pipette tips (VWR) Low Retention | VWR | 76322-528 | |
| Polyacrylamide gel solution (37.5:1) | Bio-rad | 1610158 | |
| polyethylene glycol (PEG) | Millipore Sigma | P4338-500G | |
| Pur-A-lyzer Maxi 3500 | Millipore Sigma | PURX35050 | |
| Purified recombinant DNA repair factor | N/A | N/A | |
| R 1.2/1.3 Cu 300 mesh Grids | Quantifoil | N1-C14nCu30-01 | |
| Recombinant histone octamer | N/A | N/A | |
| Spring clipping tools | SubAngostrom | CSA-01 | |
| Superdex 200 column 10/300 | Millipore Sigma | GE28-9909-44 | |
| Transmission Electron Microscope | Thermo Fisher | Talos Arctica 200 kV | |
| Tweezers Assembly for FEI Vitrobot Mark IV-I | Ted Pella | 47000-500 | |
| UltraPure Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 15514011 | |
| Vitrobot | Thermo Fisher | Mark IV System | |
| Whatman Filter paper (55 mM) | Cytiva | 1005-055 | |
| Xylene cyanol | Thermo Fisher Scientific | 440700500 | |
| Zeba Micro Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 75 µL | Thermo Fisher Scientific | 89877 |
Riferimenti
- Ehrenhofer-Murray, A. E. Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair. European Journal of Biochemistry. 271 (12), 2335-2349 (2004).
- Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
- Davey, C. A., Sargent, D. F., Luger, K., Maeder, A. W., Richmond, T. J. Solvent mediated interactions in the structure of the nucleosome core particle at 1.9 a resolution. Journal of Molecular Biology. 319 (5), 1097-1113 (2002).
- Suto, R. K., Clarkson, M. J., Tremethick, D. J., Luger, K. Crystal structure of a nucleosome core particle containing the variant histone H2A.Z. Nature Structural Biology. 7 (12), 1121-1124 (2000).
- Tachiwana, H., et al. Crystal structure of the human centromeric nucleosome containing CENP-A. Nature. 476 (7359), 232-235 (2011).
- McGinty, R. K., Tan, S. Nucleosome structure and function. Chemical Reviews. 115 (6), 2255-2273 (2015).
- Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Laughery, M. F., Wyrick, J. J., Smerdon, M. J. Site-specific acetylation of histone H3 decreases polymerase beta activity on nucleosome core particles in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11434-11445 (2016).
- Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Smerdon, M. J. Accessing DNA damage in chromatin: Preparing the chromatin landscape for base excision repair. DNA Repair (Amst). 32, 113-119 (2015).
- Rodriguez, Y., Horton, J. K., Wilson, S. H. Histone H3 lysine 56 acetylation enhances AP endonuclease 1-mediated repair of AP sites in nucleosome core particles. Biochimica. 58 (35), 3646-3655 (2019).
- Rodriguez, Y., Howard, M. J., Cuneo, M. J., Prasad, R., Wilson, S. H. Unencumbered Pol beta lyase activity in nucleosome core particles. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8901-8915 (2017).
- Rodriguez, Y., Smerdon, M. J. The structural location of DNA lesions in nucleosome core particles determines accessibility by base excision repair enzymes. The Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13863-13875 (2013).
- Olmon, E. D., Delaney, S. Differential ability of five DNA glycosylases to recognize and repair damage on nucleosomal DNA. ACS Chemical Biology. 12 (3), 692-701 (2017).
- Odell, I. D., Wallace, S. S., Pederson, D. S. Rules of engagement for base excision repair in chromatin. Journal of Cellular Physiology. 228 (2), 258-266 (2013).
- Dyer, P. N., et al. Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA. Methods in Enzymology. 375, 23-44 (2004).
- Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Preparation of nucleosome core particle from recombinant histones. Methods in Enzymology. 304, 3-19 (1999).
- McGinty, R. K., Makde, R. D., Tan, S. Preparation, crystallization, and structure determination of chromatin enzyme/nucleosome complexes. Methods in Enzymology. 573, 43-65 (2016).
- Lopez-Gomollon, S., Nicolas, F. E. Purification of DNA oligos by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Methods in Enzymology. 529, 65-83 (2013).
- Burgess, R. R. D., Murray, P. . Guide to Protein Purification. 463, (2009).
- Coscia, F., et al. Fusion to a homo-oligomeric scaffold allows cryo-EM analysis of a small protein. Scientific Reports. 6, 30909 (2016).
- Wu, X., Rapoport, T. A. Cryo-EM structure determination of small proteins by nanobody-binding scaffolds (Legobodies). Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), 2115001118 (2021).
- Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. High-resolution structure determination of sub-100 kDa complexes using conventional cryo-EM. Nature Communications. 10 (1), 1032 (2019).
- Takizawa, Y., et al. Cryo-EM structure of the nucleosome containing the ALB1 enhancer DNA sequence. Open Biology. 8 (3), 170255 (2018).
- Anderson, C. J., et al. Structural basis for recognition of ubiquitylated nucleosome by Dot1L methyltransferase. Cell Reports. 26 (7), 1681-1690 (2019).
