Denne protokollen skisserer i detalj fremstillingen av nukleosomale komplekser ved hjelp av to metoder for prøvepreparering for frysing av TEM-nett.
DNA-reparasjon i sammenheng med kromatin er dårlig forstått. Biokjemiske studier ved bruk av nukleosomkjernepartikler, den grunnleggende repeterende enheten av kromatin, viser at de fleste DNA-reparasjonsenzymer fjerner DNA-skade ved reduserte hastigheter sammenlignet med fritt DNA. De molekylære detaljene om hvordan baseeksisjonsreparasjon (BER) enzymer gjenkjenner og fjerner DNA-skade i nukleosomer har ikke blitt belyst. Imidlertid antyder biokjemiske BER-data fra nukleosomale substrater at nukleosomet presenterer forskjellige strukturelle barrierer avhengig av plasseringen av DNA-lesjonen og enzymet. Dette indikerer at mekanismene som brukes av disse enzymene for å fjerne DNA-skade i fritt DNA, kan være forskjellige fra de som brukes i nukleosomer. Gitt at flertallet av genomisk DNA er samlet inn i nukleosomer, er strukturell informasjon av disse kompleksene nødvendig. Til dags dato mangler det vitenskapelige samfunn detaljerte protokoller for å utføre teknisk gjennomførbare strukturelle studier av disse kompleksene. Her gir vi to metoder for å fremstille et kompleks av to genetisk smeltede BER-enzymer (Polymerase β og AP Endonuclease1) bundet til et enkelt-nukleotidgap nær inngang-utgangen av nukleosomet for kryo-elektronmikroskopi (kryo-EM) strukturell bestemmelse. Begge metodene for prøvepreparering er kompatible for å vitrifisere kvalitetsgitter via dypfrysing. Denne protokollen kan brukes som utgangspunkt for å fremstille andre nukleosomale komplekser med forskjellige BER-faktorer, pionertranskripsjonsfaktorer og kromatinmodifiserende enzymer.
Eukaryot DNA er organisert og komprimert av histonproteiner, som danner kromatin. Nukleosomkjernepartikkelen (NCP) utgjør den grunnleggende repeterende enheten av kromatin som regulerer tilgjengeligheten til DNA-bindende proteiner for DNA-reparasjon, transkripsjon og replikasjon1. Selv om den første røntgenkrystallstrukturen til NCP først ble løst for mer enn to tiår siden2 og mange flere strukturer av NCP har blitt publisert siden 3,4,5,6, har DNA-reparasjonsmekanismer i nukleosomale substrater ennå ikke blitt avgrenset. Å avdekke de molekylære detaljene som ligger til grunn for DNA-reparasjon i kromatin vil kreve strukturell karakterisering av de deltakende komponentene for å forstå hvordan lokale strukturelle trekk ved NCP regulerer DNA-reparasjonsaktiviteter. Dette er spesielt viktig i sammenheng med baseeksisjonsreparasjon (BER), gitt at biokjemiske studier med BER-enzymer antyder unike DNA-reparasjonsmekanismer i nukleosomer som er avhengige av enzymspesifikke strukturelle krav til katalyse og strukturposisjonen til DNA-lesjonen i nukleosomet 7,8,9,10,11,12,13 . Gitt at BER er en viktig DNA-reparasjonsprosess, er det stor interesse for å fylle ut disse hullene, samtidig som det etableres et utgangspunkt hvorfra andre teknisk gjennomførbare strukturelle studier som involverer relevante nukleosomale komplekser kan utføres.
Cryo-EM er raskt i ferd med å bli den foretrukne metoden for å løse den tredimensjonale (3D) strukturen til komplekser hvis storskala fremstilling av homogen prøve er utfordrende. Selv om design og rensing av kontaktpunkter kompleksert med en DNA-reparasjonsfaktor (NCP-DRF) sannsynligvis vil kreve skreddersydd optimalisering, gir prosedyren som presenteres her for å generere og fryse et stabilt NCP-DRF-kompleks detaljer om hvordan man optimaliserer prøven og klargjøring av kryo-EM-nettet. To arbeidsflyter (ikke gjensidig utelukkende) vist i figur 1, og de spesifikke detaljene i protokollen identifiserer kritiske trinn og gir strategier for å optimalisere disse trinnene. Dette arbeidet vil drive kromatin- og DNA-reparasjonsfeltet i en retning der komplementering av biokjemiske med strukturelle studier blir teknisk mulig for bedre å forstå molekylære mekanismer for nukleosomal DNA-reparasjon.
En spesifikk protokoll for rensing av DNA-reparasjonsfaktoren vil være avhengig av enzymet av interesse. Imidlertid er det noen generelle anbefalinger, inkludert bruk av rekombinante metoder for proteinuttrykk og rensing18; Hvis proteinet av interesse er for lite (<50 kDa), hadde strukturbestemmelse av cryo-EM vært nesten umulig inntil nylig gjennom bruk av fusjonssystemer19, nanokroppsbindende stillas20 og optimalisering av bildestrategier<sup cla…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Mario Borgnia fra kryo-EM-kjernen ved National Institute of Environmental Health Sciences og Dr. Joshua Strauss fra University of North Carolina på Chapel Hill for deres mentorskap og opplæring i cryo-EM-nettforberedelsen. Vi takker også Dr. Juliana Mello Da Fonseca Rezende for teknisk assistanse i de innledende stadiene av dette prosjektet. Vi setter pris på nøkkelbidraget og støtten til avdøde Dr. Samuel H. Wilson og hans laboratoriemedlemmer, spesielt Dr. Rajendra Prasad og Dr. Joonas Jamsen for rensing av det genetisk smeltede APE1-Polβ-komplekset. Forskning har blitt støttet av det intramurale forskningsprogrammet til National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences [tilskuddsnummer Z01ES050158, Z01ES050159 og K99ES031662-01].
1 M HEPES; pH 7.5 | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
1 M MgCl2 | Thermo Fisher Scientific | AM9530G | |
10x TBE | Bio-rad | 1610733 | |
25% glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
3 M KCl | Thermo Fisher Scientific | 043398.K2 | |
491 prep cell | Bio-rad | 1702926 | |
Amicon Ultra 15 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) | Millipore Sigma | Z717185 | |
Amicon Ultra 4 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) | Millipore Sigma | UFC8030 | |
AutoGrid Tweezers | Ted Pella | 47000-600 | |
Automatic Plunge Freezer | Leica | Leica EM GP | |
C-1000 touch thermocycler | Bio-rad | 1851148 | |
C-clips and rings | Thermo Fisher | 6640–6640 | |
Clipping station | SubAngostrom | SCT08 | |
Dialysis Membrane (MW cufoff 6-8 kDa) | Fisher Scientific | 15370752 | |
Diamond Tweezers | Techni-Pro | 758TW0010 | |
dsDNA | Integrated DNA techonologies | N/A | |
FEI Titan Krios | Thermo Fisher | KRIOSG4TEM | |
FPLC purification system | AKTA Pure | 29018224 | |
Fraction collector Model 2110 | Bio-rad | 7318122 | |
Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella | 91000S | |
Grid Boxes | SubAngostrom | PB-E | |
Grid Storage Accessory Pack | SubAngostrom | GSAX | |
Liquid Ethane | N/A | N/A | |
Liquid Nitrogen | N/A | N/A | |
Minipuls 3 peristaltic two-head pump | Gilson | F155008 | |
Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
Novex 16%, Tricine, 1.0 mm, Mini Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | EC6695BOX | |
Pipetman | Gilson | FA10002M | |
Pipette tips (VWR) Low Retention | VWR | 76322-528 | |
Polyacrylamide gel solution (37.5:1) | Bio-rad | 1610158 | |
polyethylene glycol (PEG) | Millipore Sigma | P4338-500G | |
Pur-A-lyzer Maxi 3500 | Millipore Sigma | PURX35050 | |
Purified recombinant DNA repair factor | N/A | N/A | |
R 1.2/1.3 Cu 300 mesh Grids | Quantifoil | N1-C14nCu30-01 | |
Recombinant histone octamer | N/A | N/A | |
Spring clipping tools | SubAngostrom | CSA-01 | |
Superdex 200 column 10/300 | Millipore Sigma | GE28-9909-44 | |
Transmission Electron Microscope | Thermo Fisher | Talos Arctica 200 kV | |
Tweezers Assembly for FEI Vitrobot Mark IV-I | Ted Pella | 47000-500 | |
UltraPure Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 15514011 | |
Vitrobot | Thermo Fisher | Mark IV System | |
Whatman Filter paper (55 mM) | Cytiva | 1005-055 | |
Xylene cyanol | Thermo Fisher Scientific | 440700500 | |
Zeba Micro Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 75 µL | Thermo Fisher Scientific | 89877 |