Fremstilling af nukleosomkernepartikler kompleksbundet med DNA-reparationsfaktorer til kryo-elektronmikroskopi strukturbestemmelse
Summary
Denne protokol beskriver detaljeret fremstillingen af nukleosomale komplekser ved anvendelse af to metoder til prøveforberedelse til frysning af TEM-gitter.
Abstract
DNA-reparation i forbindelse med kromatin er dårligt forstået. Biokemiske undersøgelser ved hjælp af nukleosomkernepartikler, den grundlæggende gentagne enhed af kromatin, viser, at de fleste DNA-reparationsenzymer fjerner DNA-skader med reducerede hastigheder sammenlignet med frit DNA. De molekylære detaljer om, hvordan base excision repair (BER) enzymer genkender og fjerner DNA-skader i nukleosomer, er ikke blevet belyst. Biokemiske BER-data for nukleosomale substrater antyder imidlertid, at nukleosomet præsenterer forskellige strukturelle barrierer afhængigt af placeringen af DNA-læsionen og enzymet. Dette indikerer, at de mekanismer, der anvendes af disse enzymer til at fjerne DNA-skader i frit DNA, kan være forskellige fra dem, der anvendes i nukleosomer. I betragtning af at størstedelen af genomisk DNA samles i nukleosomer, er der behov for strukturel information om disse komplekser. Hidtil mangler det videnskabelige samfund detaljerede protokoller til at udføre teknisk gennemførlige strukturelle undersøgelser af disse komplekser. Her giver vi to metoder til at forberede et kompleks af to genetisk smeltede BER-enzymer (Polymerase β og AP Endonuclease1) bundet til et enkeltnukleotidgab nær nukleosomets indgang-udgang til kryo-elektronmikroskopi (kryo-EM) strukturbestemmelse. Begge metoder til prøveforberedelse er kompatible til forglasning af kvalitetsgitre via dybfrysning. Denne protokol kan bruges som udgangspunkt til at forberede andre nukleosomale komplekser med forskellige BER-faktorer, pionertranskriptionsfaktorer og kromatinmodificerende enzymer.
Introduction
Eukaryot DNA er organiseret og komprimeret af histonproteiner, der danner kromatin. Nukleosomkernepartiklen (NCP) udgør den grundlæggende gentagne enhed af kromatin, der regulerer tilgængeligheden til DNA-bindende proteiner til DNA-reparation, transkription og replikation1. Selvom den første røntgenkrystalstruktur af NCP først blev løst for mere end to årtier siden2, og mange flere strukturer i NCP er blevet offentliggjort siden 3,4,5,6, er DNA-reparationsmekanismer i nukleosomale substrater endnu ikke blevet afgrænset. Afdækning af de molekylære detaljer, der ligger til grund for DNA-reparation i kromatin, vil kræve strukturel karakterisering af de deltagende komponenter for at forstå, hvordan lokale strukturelle træk ved NCP regulerer DNA-reparationsaktiviteter. Dette er især vigtigt i forbindelse med baseexcisionsreparation (BER), da biokemiske undersøgelser med BER-enzymer tyder på unikke DNA-reparationsmekanismer i nukleosomer, der er afhængige af enzymspecifikke strukturelle krav til katalyse og DNA-læsionens strukturelle position i nukleosomet 7,8,9,10,11,12,13 . Da BER er en vital DNA-reparationsproces, er der stor interesse for at udfylde disse huller, samtidig med at der etableres et udgangspunkt, hvorfra andre teknisk gennemførlige strukturelle undersøgelser, der involverer relevante nukleosomale komplekser, kan udføres.
Cryo-EM er hurtigt ved at blive den foretrukne metode til løsning af den tredimensionelle (3D) struktur af komplekser, hvis storskala forberedelse af homogen prøve er udfordrende. Selvom design og oprensning af NCP’er kompleksbundet med en DNA-reparationsfaktor (NCP-DRF) sandsynligvis vil kræve skræddersyet optimering, giver proceduren, der præsenteres her for at generere og fryse et stabilt NCP-DRF-kompleks, detaljer om, hvordan man optimerer prøven og kryo-EM-gitterforberedelsen. To arbejdsprocesser (udelukker ikke hinanden) vist i figur 1 og de specifikke detaljer i protokollen identificerer kritiske trin og giver strategier til optimering af disse trin. Dette arbejde vil drive kromatin- og DNA-reparationsfeltet i en retning, hvor komplementaritet med biokemiske med strukturelle undersøgelser bliver teknisk muligt for bedre at forstå de molekylære mekanismer for nukleosomal DNA-reparation.
Protocol
Representative Results
Discussion
En specifik protokol til rensning af DNA-reparationsfaktoren vil være afhængig af enzymet af interesse. Der er dog nogle generelle anbefalinger, herunder anvendelse af rekombinante metoder til proteinekspression og oprensning18; hvis proteinet af interesse er for lille (<50 kDa), havde strukturbestemmelse ved kryo-EM været næsten umulig indtil for nylig ved brug af fusionssystemer19, nanobody-bindende stilladser20 og optimering af billeddannelses…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Mario Borgnia fra cryo-EM-kernen ved National Institute of Environmental Health Sciences og Dr. Joshua Strauss fra University of North Carolina i Chapel Hill for deres mentorskab og træning i cryo-EM-gitterforberedelsen. Vi takker også Dr. Juliana Mello Da Fonseca Rezende for teknisk assistance i de indledende faser af dette projekt. Vi sætter pris på det vigtige bidrag og støtte fra afdøde Dr. Samuel H. Wilson og hans laboratoriemedlemmer, især Dr. Rajendra Prasad og Dr. Joonas Jamsen til oprensning af det genetisk smeltede APE1-Polβ-kompleks. Forskning er blevet støttet af Intramural Research Program fra National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences [bevillingsnumre Z01ES050158, Z01ES050159 og K99ES031662-01].
Materials
| 1 M HEPES; pH 7.5 | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| 1 M MgCl2 | Thermo Fisher Scientific | AM9530G | |
| 10x TBE | Bio-rad | 1610733 | |
| 25% glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| 3 M KCl | Thermo Fisher Scientific | 043398.K2 | |
| 491 prep cell | Bio-rad | 1702926 | |
| Amicon Ultra 15 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) | Millipore Sigma | Z717185 | |
| Amicon Ultra 4 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) | Millipore Sigma | UFC8030 | |
| AutoGrid Tweezers | Ted Pella | 47000-600 | |
| Automatic Plunge Freezer | Leica | Leica EM GP | |
| C-1000 touch thermocycler | Bio-rad | 1851148 | |
| C-clips and rings | Thermo Fisher | 6640–6640 | |
| Clipping station | SubAngostrom | SCT08 | |
| Dialysis Membrane (MW cufoff 6-8 kDa) | Fisher Scientific | 15370752 | |
| Diamond Tweezers | Techni-Pro | 758TW0010 | |
| dsDNA | Integrated DNA techonologies | N/A | |
| FEI Titan Krios | Thermo Fisher | KRIOSG4TEM | |
| FPLC purification system | AKTA Pure | 29018224 | |
| Fraction collector Model 2110 | Bio-rad | 7318122 | |
| Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella | 91000S | |
| Grid Boxes | SubAngostrom | PB-E | |
| Grid Storage Accessory Pack | SubAngostrom | GSAX | |
| Liquid Ethane | N/A | N/A | |
| Liquid Nitrogen | N/A | N/A | |
| Minipuls 3 peristaltic two-head pump | Gilson | F155008 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| Novex 16%, Tricine, 1.0 mm, Mini Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | EC6695BOX | |
| Pipetman | Gilson | FA10002M | |
| Pipette tips (VWR) Low Retention | VWR | 76322-528 | |
| Polyacrylamide gel solution (37.5:1) | Bio-rad | 1610158 | |
| polyethylene glycol (PEG) | Millipore Sigma | P4338-500G | |
| Pur-A-lyzer Maxi 3500 | Millipore Sigma | PURX35050 | |
| Purified recombinant DNA repair factor | N/A | N/A | |
| R 1.2/1.3 Cu 300 mesh Grids | Quantifoil | N1-C14nCu30-01 | |
| Recombinant histone octamer | N/A | N/A | |
| Spring clipping tools | SubAngostrom | CSA-01 | |
| Superdex 200 column 10/300 | Millipore Sigma | GE28-9909-44 | |
| Transmission Electron Microscope | Thermo Fisher | Talos Arctica 200 kV | |
| Tweezers Assembly for FEI Vitrobot Mark IV-I | Ted Pella | 47000-500 | |
| UltraPure Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 15514011 | |
| Vitrobot | Thermo Fisher | Mark IV System | |
| Whatman Filter paper (55 mM) | Cytiva | 1005-055 | |
| Xylene cyanol | Thermo Fisher Scientific | 440700500 | |
| Zeba Micro Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 75 µL | Thermo Fisher Scientific | 89877 |
Riferimenti
- Ehrenhofer-Murray, A. E. Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair. European Journal of Biochemistry. 271 (12), 2335-2349 (2004).
- Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
- Davey, C. A., Sargent, D. F., Luger, K., Maeder, A. W., Richmond, T. J. Solvent mediated interactions in the structure of the nucleosome core particle at 1.9 a resolution. Journal of Molecular Biology. 319 (5), 1097-1113 (2002).
- Suto, R. K., Clarkson, M. J., Tremethick, D. J., Luger, K. Crystal structure of a nucleosome core particle containing the variant histone H2A.Z. Nature Structural Biology. 7 (12), 1121-1124 (2000).
- Tachiwana, H., et al. Crystal structure of the human centromeric nucleosome containing CENP-A. Nature. 476 (7359), 232-235 (2011).
- McGinty, R. K., Tan, S. Nucleosome structure and function. Chemical Reviews. 115 (6), 2255-2273 (2015).
- Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Laughery, M. F., Wyrick, J. J., Smerdon, M. J. Site-specific acetylation of histone H3 decreases polymerase beta activity on nucleosome core particles in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11434-11445 (2016).
- Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Smerdon, M. J. Accessing DNA damage in chromatin: Preparing the chromatin landscape for base excision repair. DNA Repair (Amst). 32, 113-119 (2015).
- Rodriguez, Y., Horton, J. K., Wilson, S. H. Histone H3 lysine 56 acetylation enhances AP endonuclease 1-mediated repair of AP sites in nucleosome core particles. Biochimica. 58 (35), 3646-3655 (2019).
- Rodriguez, Y., Howard, M. J., Cuneo, M. J., Prasad, R., Wilson, S. H. Unencumbered Pol beta lyase activity in nucleosome core particles. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8901-8915 (2017).
- Rodriguez, Y., Smerdon, M. J. The structural location of DNA lesions in nucleosome core particles determines accessibility by base excision repair enzymes. The Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13863-13875 (2013).
- Olmon, E. D., Delaney, S. Differential ability of five DNA glycosylases to recognize and repair damage on nucleosomal DNA. ACS Chemical Biology. 12 (3), 692-701 (2017).
- Odell, I. D., Wallace, S. S., Pederson, D. S. Rules of engagement for base excision repair in chromatin. Journal of Cellular Physiology. 228 (2), 258-266 (2013).
- Dyer, P. N., et al. Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA. Methods in Enzymology. 375, 23-44 (2004).
- Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Preparation of nucleosome core particle from recombinant histones. Methods in Enzymology. 304, 3-19 (1999).
- McGinty, R. K., Makde, R. D., Tan, S. Preparation, crystallization, and structure determination of chromatin enzyme/nucleosome complexes. Methods in Enzymology. 573, 43-65 (2016).
- Lopez-Gomollon, S., Nicolas, F. E. Purification of DNA oligos by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Methods in Enzymology. 529, 65-83 (2013).
- Burgess, R. R. D., Murray, P. . Guide to Protein Purification. 463, (2009).
- Coscia, F., et al. Fusion to a homo-oligomeric scaffold allows cryo-EM analysis of a small protein. Scientific Reports. 6, 30909 (2016).
- Wu, X., Rapoport, T. A. Cryo-EM structure determination of small proteins by nanobody-binding scaffolds (Legobodies). Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), 2115001118 (2021).
- Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. High-resolution structure determination of sub-100 kDa complexes using conventional cryo-EM. Nature Communications. 10 (1), 1032 (2019).
- Takizawa, Y., et al. Cryo-EM structure of the nucleosome containing the ALB1 enhancer DNA sequence. Open Biology. 8 (3), 170255 (2018).
- Anderson, C. J., et al. Structural basis for recognition of ubiquitylated nucleosome by Dot1L methyltransferase. Cell Reports. 26 (7), 1681-1690 (2019).
