क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी संरचनात्मक निर्धारण के लिए डीएनए मरम्मत कारकों के साथ जटिल न्यूक्लियोसोम कोर कणों की तैयारी
Summary
यह प्रोटोकॉल फ्रीजिंग टीईएम ग्रिड के लिए नमूना तैयारी के दो तरीकों का उपयोग करके न्यूक्लियोसोमल कॉम्प्लेक्स की तैयारी को विस्तार से रेखांकित करता है।
Abstract
क्रोमैटिन के संदर्भ में डीएनए की मरम्मत को खराब तरीके से समझा जाता है। न्यूक्लियोसोम कोर कणों का उपयोग करने वाले जैव रासायनिक अध्ययन, क्रोमैटिन की मौलिक दोहराई जाने वाली इकाई, दिखाते हैं कि अधिकांश डीएनए मरम्मत एंजाइम मुक्त डीएनए की तुलना में कम दरों पर डीएनए क्षति को हटाते हैं। न्यूक्लियोसोम में डीएनए क्षति को कैसे पहचानते हैं और हटाते हैं, इस पर आणविक विवरण स्पष्ट नहीं किया गया है। हालांकि, न्यूक्लियोसोमल सब्सट्रेट्स के जैव रासायनिक बीईआर डेटा से पता चलता है कि न्यूक्लियोसोम डीएनए घाव और एंजाइम के स्थान पर निर्भर विभिन्न संरचनात्मक बाधाओं को प्रस्तुत करता है। यह इंगित करता है कि मुक्त डीएनए में डीएनए क्षति को हटाने के लिए इन एंजाइमों द्वारा नियोजित तंत्र न्यूक्लियोसोम में नियोजित लोगों की तुलना में अलग हो सकते हैं। यह देखते हुए कि अधिकांश जीनोमिक डीएनए न्यूक्लियोसोम में इकट्ठा होते हैं, इन परिसरों की संरचनात्मक जानकारी की आवश्यकता होती है। आज तक, वैज्ञानिक समुदाय में इन परिसरों के तकनीकी रूप से व्यवहार्य संरचनात्मक अध्ययन करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल का अभाव है। यहां, हम क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) संरचनात्मक निर्धारण के लिए न्यूक्लियोसोम के प्रवेश-निकास के पास एकल-न्यूक्लियोटाइड अंतर से बंधे दो आनुवंशिक रूप से फ्यूज्ड बीईआर एंजाइमों (पोलीमरेज़ β और एपी एंडोन्यूक्लिज़ 1) के एक परिसर को तैयार करने के लिए दो तरीके प्रदान करते हैं। नमूना तैयार करने के दोनों तरीके ठंड के माध्यम से गुणवत्ता ग्रिड को मजबूत करने के लिए संगत हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग विभिन्न बीईआर कारकों, अग्रणी प्रतिलेखन कारकों और क्रोमैटिन-संशोधित एंजाइमों के साथ अन्य न्यूक्लियोसोमल परिसरों को तैयार करने के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में किया जा सकता है।
Introduction
यूकेरियोटिक डीएनए हिस्टोन प्रोटीन द्वारा व्यवस्थित और कॉम्पैक्ट होता है, जिससे क्रोमैटिन बनता है। न्यूक्लियोसोम कोर कण (एनसीपी) क्रोमैटिन की मौलिक दोहराई जाने वाली इकाई का गठन करता है जो डीएनए की मरम्मत, प्रतिलेखन और प्रतिकृति1 के लिए डीएनए-बाध्यकारी प्रोटीन तक पहुंच को नियंत्रित करता है। यद्यपि एनसीपी की पहली एक्स-रे क्रिस्टल संरचना को पहली बार दो दशक पहले हल किया गया था2 और एनसीपी की कई और संरचनाएं 3,4,5,6 के बाद से प्रकाशित हुई हैं, न्यूक्लियोसोमल सब्सट्रेट्स में डीएनए मरम्मत तंत्र अभी तक चित्रित नहीं किए गए हैं। क्रोमैटिन में डीएनए मरम्मत के अंतर्निहित आणविक विवरणों को उजागर करने के लिए भाग लेने वाले घटकों के संरचनात्मक लक्षण वर्णन की आवश्यकता होगी ताकि यह समझा जा सके कि एनसीपी की स्थानीय संरचनात्मक विशेषताएं डीएनए मरम्मत गतिविधियों को कैसे नियंत्रित करती हैं। यह बेस एक्सिशन रिपेयर (बीईआर) के संदर्भ में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, यह देखते हुए कि बीईआर एंजाइमों के साथ जैव रासायनिक अध्ययन न्यूक्लियोसोम में अद्वितीय डीएनए मरम्मत तंत्र का सुझाव देते हैं जो उत्प्रेरण के लिए एंजाइम-विशिष्ट संरचनात्मक आवश्यकताओं और न्यूक्लियोसोम 7,8,9,10,11,12,13 के भीतर डीएनए घाव की संरचनात्मक स्थिति पर निर्भर हैं। . यह देखते हुए कि बीईआर एक महत्वपूर्ण डीएनए मरम्मत प्रक्रिया है, इन अंतरालों को भरने के लिए काफी रुचि है, जबकि एक प्रारंभिक बिंदु भी स्थापित किया गया है जहां से प्रासंगिक न्यूक्लियोसोमल परिसरों से जुड़े अन्य तकनीकी रूप से व्यवहार्य संरचनात्मक अध्ययन किए जा सकते हैं।
क्रायो-ईएम तेजी से परिसरों की त्रि-आयामी (3 डी) संरचना को हल करने के लिए पसंद की विधि बन रहा है, जिनके सजातीय नमूने की बड़े पैमाने पर तैयारी चुनौतीपूर्ण है। हालांकि, डीएनए मरम्मत कारक (एनसीपी-डीआरएफ) के साथ जटिल एनसीपी के डिजाइन और शुद्धिकरण के लिए अनुरूप अनुकूलन की आवश्यकता होगी, एक स्थिर एनसीपी-डीआरएफ कॉम्प्लेक्स उत्पन्न करने और फ्रीज करने के लिए यहां प्रस्तुत प्रक्रिया नमूना और क्रायो-ईएम ग्रिड तैयारी को अनुकूलित करने के तरीके पर विवरण प्रदान करती है। चित्रा 1 में दिखाए गए दो वर्कफ़्लो (पारस्परिक रूप से अनन्य नहीं) और प्रोटोकॉल में विशिष्ट विवरण महत्वपूर्ण चरणों की पहचान करते हैं और इन चरणों को अनुकूलित करने के लिए रणनीतिप्रदान करते हैं। यह काम क्रोमैटिन और डीएनए मरम्मत क्षेत्र को एक दिशा में आगे बढ़ाएगा जहां संरचनात्मक अध्ययन के साथ जैव रासायनिक पूरक न्यूक्लियोसोमल डीएनए मरम्मत के आणविक तंत्र को बेहतर ढंग से समझने के लिए तकनीकी रूप से संभव हो जाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
डीएनए मरम्मत कारक को शुद्ध करने के लिए एक विशिष्ट प्रोटोकॉल ब्याज के एंजाइम पर निर्भर होगा। हालांकि, कुछ सामान्य सिफारिशें हैं, जिनमें प्रोटीन अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण के लिए पुनः संयोजक तरीकों का उप?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ एनवायरनमेंटल हेल्थ साइंसेज में क्रायो-ईएम कोर से डॉ मारियो बोर्गनिया और चैपल हिल में उत्तरी कैरोलिना विश्वविद्यालय के डॉ जोशुआ स्ट्रॉस को क्रायो-ईएम ग्रिड तैयारी में उनके परामर्श और प्रशिक्षण के लिए धन्यवाद देते हैं। हम इस परियोजना के प्रारंभिक चरणों में तकनीकी सहायता के लिए डॉ जूलियाना मेलो दा फोंसेका रेजेंडे को भी धन्यवाद देते हैं। हम आनुवंशिक रूप से जुड़े एपीई 1-पोलो कॉम्प्लेक्स के शुद्धिकरण के लिए स्वर्गीय डॉ सैमुअल एच विल्सन और उनके प्रयोगशाला सदस्यों, विशेष रूप से डॉ राजेंद्र प्रसाद और डॉ जूनास जैमसेन के महत्वपूर्ण योगदान और समर्थन की सराहना करते हैं। अनुसंधान को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ एनवायरनमेंटल हेल्थ साइंसेज [अनुदान संख्या Z01ES050158, Z01ES050159, और K99ES031662-01] के इंट्राम्यूरल रिसर्च प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया है।
Materials
| 1 M HEPES; pH 7.5 | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| 1 M MgCl2 | Thermo Fisher Scientific | AM9530G | |
| 10x TBE | Bio-rad | 1610733 | |
| 25% glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| 3 M KCl | Thermo Fisher Scientific | 043398.K2 | |
| 491 prep cell | Bio-rad | 1702926 | |
| Amicon Ultra 15 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) | Millipore Sigma | Z717185 | |
| Amicon Ultra 4 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) | Millipore Sigma | UFC8030 | |
| AutoGrid Tweezers | Ted Pella | 47000-600 | |
| Automatic Plunge Freezer | Leica | Leica EM GP | |
| C-1000 touch thermocycler | Bio-rad | 1851148 | |
| C-clips and rings | Thermo Fisher | 6640–6640 | |
| Clipping station | SubAngostrom | SCT08 | |
| Dialysis Membrane (MW cufoff 6-8 kDa) | Fisher Scientific | 15370752 | |
| Diamond Tweezers | Techni-Pro | 758TW0010 | |
| dsDNA | Integrated DNA techonologies | N/A | |
| FEI Titan Krios | Thermo Fisher | KRIOSG4TEM | |
| FPLC purification system | AKTA Pure | 29018224 | |
| Fraction collector Model 2110 | Bio-rad | 7318122 | |
| Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella | 91000S | |
| Grid Boxes | SubAngostrom | PB-E | |
| Grid Storage Accessory Pack | SubAngostrom | GSAX | |
| Liquid Ethane | N/A | N/A | |
| Liquid Nitrogen | N/A | N/A | |
| Minipuls 3 peristaltic two-head pump | Gilson | F155008 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| Novex 16%, Tricine, 1.0 mm, Mini Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | EC6695BOX | |
| Pipetman | Gilson | FA10002M | |
| Pipette tips (VWR) Low Retention | VWR | 76322-528 | |
| Polyacrylamide gel solution (37.5:1) | Bio-rad | 1610158 | |
| polyethylene glycol (PEG) | Millipore Sigma | P4338-500G | |
| Pur-A-lyzer Maxi 3500 | Millipore Sigma | PURX35050 | |
| Purified recombinant DNA repair factor | N/A | N/A | |
| R 1.2/1.3 Cu 300 mesh Grids | Quantifoil | N1-C14nCu30-01 | |
| Recombinant histone octamer | N/A | N/A | |
| Spring clipping tools | SubAngostrom | CSA-01 | |
| Superdex 200 column 10/300 | Millipore Sigma | GE28-9909-44 | |
| Transmission Electron Microscope | Thermo Fisher | Talos Arctica 200 kV | |
| Tweezers Assembly for FEI Vitrobot Mark IV-I | Ted Pella | 47000-500 | |
| UltraPure Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 15514011 | |
| Vitrobot | Thermo Fisher | Mark IV System | |
| Whatman Filter paper (55 mM) | Cytiva | 1005-055 | |
| Xylene cyanol | Thermo Fisher Scientific | 440700500 | |
| Zeba Micro Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 75 µL | Thermo Fisher Scientific | 89877 |
Riferimenti
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