जेब्राफिश में सेल जैविक और शारीरिक कार्य के लिए ऑप्टिकल स्पष्टता एक प्रमुख लाभ है। व्यक्तिगत जानवरों में कोशिका वृद्धि के माप के लिए मजबूत तरीकों का वर्णन किया गया है जो कंकाल की मांसपेशियों और पड़ोसी ऊतकों के विकास को पूरे शरीर के विकास के साथ एकीकृत करने की अनुमति देते हैं।
जीवित भ्रूण, लार्वा या किशोर ज़ेबराफिश के पूरे शरीर में अलग-अलग कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए कई तरीकों का उपयोग किया जा सकता है। हम दिखाते हैं कि फ्लोरोसेंटली-चिह्नित प्लाज्मा झिल्ली के साथ जीवित मछली को मांसपेशियों के ऊतकों की मात्रा और मौजूद मांसपेशी फाइबर की संख्या निर्धारित करने के लिए एक कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप में स्कैन किया जा सकता है। समय के साथ जीवित जानवरों में सेल संख्या और आकार के माप के लिए कुशल दृष्टिकोण का वर्णन किया गया है और अधिक कठिन विभाजन विधियों के खिलाफ मान्य किया गया है। विधियों का वर्णन किया गया है जो मांसपेशियों के विद्युत, और इस प्रकार सिकुड़ा हुआ, गतिविधि के नियंत्रण की अनुमति देते हैं। कंकाल की मांसपेशियों की सिकुड़ा हुआ गतिविधि के नुकसान ने मांसपेशियों की वृद्धि को बहुत कम कर दिया। लार्वा में, एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है जो पैटर्न वाले विद्युत-उत्पन्न सिकुड़ा हुआ गतिविधि को फिर से शुरू करने की अनुमति देता है। वर्णित विधियां अंतर-व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता के प्रभाव को कम करती हैं और जीवित जीव के संदर्भ में विभिन्न प्रकार के सेलुलर और शारीरिक विकास मापदंडों पर विद्युत, आनुवंशिक, दवा या पर्यावरणीय उत्तेजनाओं के प्रभाव के विश्लेषण की अनुमति देंगी। व्यक्तियों पर परिभाषित प्रारंभिक जीवन हस्तक्षेप के मापा प्रभावों का दीर्घकालिक अनुवर्ती बाद में किया जा सकता है।
विनियमित ऊतक विकास, जिसमें सेल संख्या (हाइपरप्लासिया) और / या सेल आकार (हाइपरट्रॉफी) में वृद्धि शामिल है, विकास, पुनर्जनन और पारिस्थितिक और विकासवादी अनुकूलन में एक महत्वपूर्ण कारक है। हाल के दशकों में कोशिका और विकासात्मक जीव विज्ञान दोनों की आणविक आनुवंशिक समझ में भारी प्रगति के बावजूद, ऊतक और अंग के आकार के विनियमन की यंत्रवत समझ अभी भी अपनी प्रारंभिक अवस्था में है। ज्ञान में इस कमी का एक कारण आवश्यक स्थानिक और लौकिक सटीकता के साथ जीवित जीवों में ऊतक वृद्धि को निर्धारित करने में कठिनाई है।
पूरे जीवों के विकास के विभिन्न पहलुओं को समय के साथ बार-बार मापा जा सकता है, जिससे प्रत्येक व्यक्ति के लिए विकास वक्र 1,2,3,4,5 का पता चलता है। तेजी से परिष्कृत स्कैनिंग विधियां, जैसे कि दोहरी एक्स-रे एब्सोप्टोमेट्री (डीएक्सए), कम्प्यूटरीकृत टोमोग्राफी (सीटी), और चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई), एकल व्यक्तियों में पूरे अंगों और अन्य शरीर के क्षेत्रों (उदाहरण के लिए, व्यक्तिगत रूप से पहचाने गए कंकाल की मांसपेशियों) के विकास की ट्रैकिंग की अनुमति देती हैं, दोनों मानव और मॉडल जीवों में 6,7,8,9,10 . हालांकि, इन विधियों में अभी तक व्यक्तिगत कोशिकाओं को प्रकट करने का संकल्प नहीं है और इस प्रकार सेलुलर व्यवहार और ऊतक स्तर के विकास के बीच संबंधों को समझना मुश्किल है। इस तरह के लिंक बनाने के लिए, पारंपरिक अध्ययनों ने अक्सर समान व्यक्तिगत जानवरों के समूहों पर भरोसा किया है, जिनमें से कुछ को लगातार समय बिंदुओं पर बलिदान किया जाता है और फिर साइटोलॉजिकल विस्तार में विश्लेषण किया जाता है। इस तरह के दृष्टिकोणों को (अधिमानतः समान, लेकिन फिर भी परिवर्तनशील) व्यक्तियों के समूहों में देखे गए परिवर्तनों को औसत करने की आवश्यकता होती है और इस प्रकार अस्थायी और स्थानिक संकल्प की कमी से पीड़ित होते हैं, जिससे सेलुलर स्तर पर सहसंबद्ध घटनाओं को ढूंढना मुश्किल हो जाता है जो कारण और प्रभाव का संकेत देते हैं।
अकशेरुकी मॉडल जीवों पर अध्ययन, शुरू में सी एलिगेंस और डी मेलानोगास्टर में, सेलुलर रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करने और एकल व्यक्तियों में समय के साथ विकास को सटीक रूप से मापने के लिए ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी विकसित करके इन समस्याओं को दरकिनार कर दिया है। इस तरह के अध्ययनों से इन छोटे मॉडल जीवों 11,12,13,14,15,16,17 के विकास में आश्चर्यजनक रूप से अपरिवर्तनीय सेल वंश व्यवहार का पता चला है। हालांकि, सभी कशेरुकियों सहित कई जानवरों में अनिश्चित कोशिका वंश होते हैं, और रहस्यमय प्रतिक्रिया प्रक्रियाओं द्वारा ऊतक विकास को नियंत्रित करते हैं जो आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड विकास कार्यक्रम को एक कार्यात्मक तीन आयामी जीव में बदलने का काम करते हैं, जिसमें इसके सभी घटक ऊतक और अंग आकार में उपयुक्त रूप से मेल खाते हैं। इन जटिल विकास प्रक्रियाओं को समझने के लिए, एकल व्यक्तियों में समय के साथ पूरे ऊतकों या अंगों की छवि बनाना वांछनीय है जिन्हें पसंद के समय आनुवंशिक, औषधीय या अन्य हस्तक्षेपों द्वारा प्रयोगात्मक रूप से हेरफेर किया जा सकता है और प्रभाव बाद में विश्लेषण किया जा सकता है।
प्रत्येक कशेरुक कंकाल की मांसपेशी में एक परिभाषित आकार, आकार और कार्य होता है, और आसन्न ऊतकों, जैसे हड्डी, कण्डरा और नसों के साथ अच्छी तरह से विशेषता वाली बातचीत होती है। कुछ मांसपेशियां छोटी होती हैं, त्वचा के नीचे लेटती हैं और इसलिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग अध्ययनों के लिए अच्छे उम्मीदवार हैं। अधिकांश अंगों के समान, प्रत्येक मांसपेशी एक स्थिर वयस्क आकार तक पहुंचने से पहले भ्रूण, प्रसवोत्तर और किशोर जीवन में बढ़ती है। मांसपेशियों में, हालांकि, वयस्क जीवन के दौरान आकार बदलने की एक अनूठी क्षमता भी है, जो उपयोग और पोषण18 पर निर्भर करती है, और इस संपत्ति का जीव फिटनेस, खेल प्रदर्शन और स्वतंत्र जीवन पर एक बड़ा प्रभाव पड़ता है। बुढ़ापे में मांसपेशियों और कार्य का नुकसान, सरकोपेनिया, 19,20,21 की उम्र बढ़ने वाली आबादी के साथ सामना करने वाले समाजों के लिए बढ़ती चिंता का मुद्दा है।
हमने और अन्य लोगों ने ज़ेब्राफिश लार्वा के खंड-दोहराए जाने वाले शरीर में कंकाल की मांसपेशी ऊतक के परिभाषित ब्लॉकों के विकास पर ध्यान केंद्रित किया है, एक स्पष्ट रूप से बंद प्रणाली के रूप में जिसमें कई सौ कोशिकाएं होती हैं जिसमें ऊतक वृद्धि, रखरखाव और मरम्मत देखी जा सकती है और 22,23,24,25,26 में हेरफेर किया जा सकता है। जबकि कुछ मात्रात्मक कार्य पहले 25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35 बताए गए हैं, समय के साथ व्यक्तिगत कशेरुक जीवों में सेलुलर विस्तार में मांसपेशियों की वृद्धि को मापने का कोई विस्तृत और मान्य तरीका उपलब्ध नहीं है। यहां इस तरह के दोहराए गए मापों को करने के तरीके के लिए एक कुशल प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है, सत्यापन के साथ, और परिवर्तित विद्युत गतिविधि के जवाब में हाइपरट्रॉफिक और हाइपरप्लास्टिक विकास दोनों में परिवर्तन का विश्लेषण करने के लिए इसके उपयोग का एक उदाहरण प्रदान किया गया है।
यहां हम चरणों में या आनुवंशिक वेरिएंट में जीवित ज़ेब्राफिश लार्वा की मांसपेशियों की मात्रा के सटीक और कुशल अनुमान के लिए एक विधि की रिपोर्ट करते हैं जिसमें रंजकता इमेजिंग के लिए एक बड़ी बाधा नहीं है औ?…
The authors have nothing to disclose.
लेखक वर्णित प्रोटोकॉल के विकास के लिए ह्यूजेस प्रयोगशाला के सदस्यों डॉ सीतारमैया अटिली, जाना कोथ, फर्नांडा बाजांका, विक्टोरिया सी विलियम्स, यानिव हिनिट्स, जॉर्जिया बर्गामिन और व्लादिमीर स्नेतकोव के प्रयासों के लिए गहराई से ऋणी हैं, और प्लास्मिड या जेब्राफिश लाइनों को साझा करने के लिए हेनरी रोहल, क्रिस्टीना हैमंड, डेविड लैंगेनौ और पीटर करी के लिए। एसएमएच एक चिकित्सा अनुसंधान परिषद (एमआरसी) वैज्ञानिक है जिसमें कार्यक्रम अनुदान जी 1001029, एमआर / एन021231/1, और एमआर / डब्ल्यू 001381/1 समर्थन है। एमए ने किंग्स कॉलेज लंदन से एमआरसी डॉक्टरेट प्रशिक्षण कार्यक्रम पीएचडी छात्र का आयोजन किया। इस काम को डेविड एम रॉबिन्सन, विद्वान, संरक्षक और दोस्त के त्रिकोणमितीय इनपुट से लाभ हुआ।
Adhesive, Blu Tack | Bostik | – | – |
Aerosol vacuum | – | – | – |
Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | – |
Agarose, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | A9414 | Once melted, keep at 37oC in a block heater to remain in liquid form for repeated use. |
Block heater | Cole-Parmer | SBH130 | – |
BODIPY FL C5-ceramide | Thermo Scientific | D3521 | To be diluted in fish water and used at 5 µM for overnight incubation. |
Crocodile clips and wires | – | – | – |
Fiji/imageJ | National Institutes of Health, NIH | – | – |
Fish medium, Fish water | – | – | Circulating system water collected from the fish facility. |
Fish medium, E3 medium | – | – | E3 is described in The Zebrafish Book. http://zfin.org (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, and 0.33 mM MgSO4 in distilled water). |
Fluorescence microscope | Leica | Leica MZ16F | Fluorescence microscope of other kind are also expected to be suitable. |
Glass needle | World Precision Instruments, Inc. | 1B100-6 | To be fire-polished to prevent damage of the embryos during manipulation. |
Grass stimulator | Grass Instruments | S88 | Stimulators of other kind are also expected to be suitable. |
Kimwipes, Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 13258179 | – |
Laser scanning microscope (LSM) | Zeiss | Zeiss LSM 5 Exciter Zeiss LSM 880 |
LSM of other kind are also expected to be suitable. |
Nunc Cell-Culture Treated, 6-well plate | Thermo Scientific | 140675 | – |
Objective, 20×/1.0W water immersion | Zeiss | – | – |
Pasteur Pipette, Graduated 1 mL | Starlab Group | E1414-0100 | – |
Pasteur Pipette, Micro Fine Tip 1 mL | Starlab Group | E1414-1100 | – |
Petri dish, 60 mm | Sigma-Aldrich | P5481 | – |
Plasmid, CMV-Cerulean | Christina L. Hammond (University of Bristol) | pCS2+_cerulean_kanR plasmid injected at 25-75 pg at one-cell stage. Citation: Bussman J, and Schulte-Merker S. (2011) Development 138:4327-4332. doi: 10.1242/dev.068080. | |
Plasmid, pCS-mCherry-CAAX | Henry Roehl (University of Sheffield) | – | For in vitro transcription using the SP6 promoter (plasmids containing other membrane labelling markers can be used); synthesised capped mRNA to be injected at 100-200 pg at one-cell stage. |
Pulse Controller | Hoefer Scientific Instruments | PC750 | – |
Soldering iron | – | – | – |
Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate/ MS-222; to be dissolved in fish water and used at 0.6 mM. |
Volocity | Perkin Elmer/Quorum Technologies Inc | – | – |
Watchmaker forceps, No. 5 | – | – | – |
Wire, Platinum | Goodfellow | PT005142/12 | 0.40 mm in diameter; an expensive alternative of silver. |
Wire, Silver | Acros Organics | 317730010 | 0.25 mm in diameter (a range of diameter i.e. 0.25-0.5 mm had been tested, which produced similar results). |
Zebrafish, myog:H2B-mRFP | David M. Langenau (Massachusetts General Hospital; Harvard Stem Cell Institute) | – | ZFIN official name: Tg(myog:Hsa.HIST1H2BJ-mRFP), fb121Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-160803-2 Citation: Tang Q, Moore JC, Ignatius MS, Tenente IM, Hayes MN, Garcia EG, Torres Yordán N, Bourque C, He S, Blackburn JS, Look AT, Houvras Y, Langenau DM. Imaging tumour cell heterogeneity following cell transplantation into optically clear immune-deficient zebrafish. Nat Commun. 2016 Jan 21;7:10358. doi: 10.1038/ncomms10358. |
Zebrafish, α-actin:mCherry-CAAX | Peter D. Currrie (ARMI, Monash University) | – | ZFIN official name: Tg(actc1b:mCherry-CAAX), pc22Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-150224-2 Citation: Berger J, Tarakci H, Berger S, Li M, Hall TE, Arner A, and Currie PD. Loss of Tropomodulin4 in the zebrafish mutant träge causes cytoplasmic rod formation and muscle weakness reminiscent of nemaline myopathy. Dis Model Mech. 2014 Dec;7(12):1407-15. doi: 10.1242/dmm.017376. |
Zebrafish, β-actin:HRAS-EGFP | – | – | ZFIN official name: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP), vu119Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-061107-2 Citation: Cooper MS, Szeto DP, Sommers-Herivel G, Topczewski J, Solnica-Krezel L, Kang HC, Johnson I, and Kimelman D. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Dev Dyn. 2005 Feb;232(2):359-68. doi: 10.1002/dvdy.20252. |
ZEN software | Zeiss | – | – |