Medición repetida y en tiempo real del crecimiento del músculo esquelético en peces cebra vivos individuales sometidos a actividad eléctrica alterada
Summary
La claridad óptica es una gran ventaja para el trabajo biológico y fisiológico celular en el pez cebra. Se describen métodos robustos para medir el crecimiento celular en animales individuales que permiten nuevos conocimientos sobre cómo el crecimiento del músculo esquelético y los tejidos vecinos se integran con el crecimiento de todo el cuerpo.
Abstract
Se pueden utilizar varios métodos para visualizar células individuales en todo el cuerpo de peces cebra embrionarios vivos, larvales o juveniles. Mostramos que los peces vivos con membranas plasmáticas marcadas con fluorescencia se pueden escanear en un microscopio de escaneo láser confocal para determinar el volumen de tejido muscular y el número de fibras musculares presentes. Se describen y validan enfoques eficientes para la medición del número y tamaño de células en animales vivos a lo largo del tiempo contra métodos de segmentación más arduos. Se describen métodos que permiten el control de la actividad eléctrica muscular y, por lo tanto, contráctil. La pérdida de la actividad contráctil del músculo esquelético redujo en gran medida el crecimiento muscular. En larvas, se describe un protocolo que permite la reintroducción de la actividad contráctil evocada eléctricamente modelada. Los métodos descritos minimizan el efecto de la variabilidad interindividual y permitirán el análisis del efecto de estímulos eléctricos, genéticos, farmacológicos o ambientales en una variedad de parámetros de crecimiento celular y fisiológico en el contexto del organismo vivo. Posteriormente se puede realizar un seguimiento a largo plazo de los efectos medidos de una intervención definida en los primeros años de vida en los individuos.
Introduction
El crecimiento regulado del tejido, que comprende el aumento del número de células (hiperplasia) y / o el tamaño de las células (hipertrofia), es un factor crucial en el desarrollo, la regeneración y la adaptación ecológica y evolutiva. A pesar de los enormes avances en la comprensión genética molecular de la biología celular y del desarrollo en las últimas décadas, la comprensión mecanicista de la regulación del tamaño de los tejidos y órganos todavía está en su infancia. Una de las razones de esta laguna en el conocimiento es la dificultad de cuantificar el crecimiento de tejidos en organismos vivos con la precisión espacial y temporal necesaria.
Varios aspectos del crecimiento de organismos enteros se pueden medir repetidamente a lo largo del tiempo, revelando curvas de crecimiento para cada individuo 1,2,3,4,5. Los métodos de exploración cada vez más sofisticados, como la absorciometría dual de rayos X (DXA), la tomografía computarizada (TC) y la resonancia magnética (RM), permiten el seguimiento del crecimiento de órganos completos y otras regiones del cuerpo (por ejemplo, músculos esqueléticos identificados individualmente) en individuos individuales, tanto humanos como en organismos modelo 6,7,8,9,10 . Sin embargo, estos métodos aún no tienen la resolución para revelar células individuales y, por lo tanto, los vínculos entre los comportamientos celulares y el crecimiento a nivel de tejido han sido difíciles de discernir. Para establecer tales vínculos, los estudios tradicionales a menudo se han basado en cohortes de animales individuales similares, algunos de los cuales se sacrifican en puntos de tiempo sucesivos y luego se analizan en detalle citológico. Tales enfoques requieren promediar los cambios observados entre grupos de individuos (preferiblemente similares, pero no obstante variables) y, por lo tanto, sufren de una falta de resolución temporal y espacial, lo que dificulta encontrar eventos correlacionados a nivel celular que sugieran causa y efecto.
Los estudios sobre organismos modelo de invertebrados, inicialmente en C. elegans y D. melanogaster, han eludido estos problemas mediante el desarrollo de microscopía óptica para lograr la resolución celular y medir con precisión el crecimiento a lo largo del tiempo en individuos individuales. Tales estudios han revelado comportamientos de linaje celular sorprendentemente invariantes en el crecimiento de estos pequeños organismos modelo 11,12,13,14,15,16,17. Sin embargo, muchos animales, incluidos todos los vertebrados, tienen linajes celulares indeterminados y controlan el crecimiento de los tejidos mediante misteriosos procesos de retroalimentación que sirven para convertir el programa de crecimiento codificado genéticamente en un organismo tridimensional funcional con todos sus tejidos y órganos constituyentes adecuadamente emparejados en tamaño. Para comprender estos complejos procesos de crecimiento, es deseable obtener imágenes de tejidos u órganos completos a lo largo del tiempo en individuos individuales que puedan manipularse experimentalmente mediante intervenciones genéticas, farmacológicas u otras en el momento de su elección y el efecto se analice posteriormente.
Cada músculo esquelético vertebrado tiene un tamaño, forma y función definidos, e interacciones bien caracterizadas con tejidos adyacentes, como huesos, tendones y nervios. Algunos músculos son pequeños, se encuentran justo debajo de la piel y, por lo tanto, son buenos candidatos para estudios de imágenes de alta resolución. Al igual que la mayoría de los órganos, cada músculo crece a lo largo de la vida embrionaria, postnatal y juvenil, antes de alcanzar un tamaño adulto estable. El músculo, sin embargo, también tiene una capacidad única para cambiar de tamaño durante la vida adulta, dependiendo del uso y la nutrición18, y esta propiedad tiene un gran impacto en la aptitud del organismo, el rendimiento deportivo y la vida independiente. La pérdida de masa muscular y de función en la vejez, la sarcopenia, es un tema de creciente preocupación para las sociedades que se enfrentan a una población envejecida 19,20,21.
Nosotros y otros nos hemos centrado en el crecimiento de bloques definidos de tejido muscular esquelético en el cuerpo segmentariamente repetitivo de larvas de pez cebra, como un sistema aparentemente cerrado que contiene varios cientos de células en las que se puede observar y manipular el crecimiento, mantenimiento y reparación de tejidos 22,23,24,25,26. Si bien se ha informado previamente de algunos trabajos cuantitativos 25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35, no se dispone de un método detallado y validado para medir el crecimiento muscular en detalle celular en organismos vertebrados individuales a lo largo del tiempo. Aquí se describe un protocolo eficiente sobre cómo realizar tales mediciones repetidas, junto con la validación, y se proporciona un ejemplo de su uso para analizar los cambios en el crecimiento hipertrófico e hiperplásico en respuesta a la actividad eléctrica alterada.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí presentamos un método para la estimación precisa y eficiente del volumen muscular de larvas vivas de pez cebra en etapas o en variantes genéticas en las que la pigmentación no es un gran obstáculo para la obtención de imágenes y cuando la anestesia transitoria y / o la inmovilización son bien toleradas. Mientras que hemos empleado microscopía confocal de escaneo láser, los enfoques descritos son aplicables a la microscopía confocal de disco giratorio o de hoja de luz y a cualquier otro método que cree p…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores están profundamente en deuda con los esfuerzos de los miembros del laboratorio de Hughes, los doctores Seetharamaiah Attili, Jana Koth, Fernanda Bajanca, Victoria C. Williams, Yaniv Hinits, Giorgia Bergamin y Vladimir Snetkov para el desarrollo de los protocolos descritos, y con Henry Roehl, Christina Hammond, David Langenau y Peter Currie por compartir plásmidos o líneas de pez cebra. SMH es un científico del Consejo de Investigación Médica (MRC) con subvenciones del programa G1001029, MR / N021231 / 1 y MR / W001381 / 1 de apoyo. MA tuvo una beca de doctorado del Programa de Formación Doctoral MRC del King’s College de Londres. Este trabajo se benefició de la aportación trigonométrica de David M. Robinson, erudito, mentor y amigo.
Materials
| Adhesive, Blu Tack | Bostik | – | – |
| Aerosol vacuum | – | – | – |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | – |
| Agarose, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | A9414 | Once melted, keep at 37oC in a block heater to remain in liquid form for repeated use. |
| Block heater | Cole-Parmer | SBH130 | – |
| BODIPY FL C5-ceramide | Thermo Scientific | D3521 | To be diluted in fish water and used at 5 µM for overnight incubation. |
| Crocodile clips and wires | – | – | – |
| Fiji/imageJ | National Institutes of Health, NIH | – | – |
| Fish medium, Fish water | – | – | Circulating system water collected from the fish facility. |
| Fish medium, E3 medium | – | – | E3 is described in The Zebrafish Book. http://zfin.org (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, and 0.33 mM MgSO4 in distilled water). |
| Fluorescence microscope | Leica | Leica MZ16F | Fluorescence microscope of other kind are also expected to be suitable. |
| Glass needle | World Precision Instruments, Inc. | 1B100-6 | To be fire-polished to prevent damage of the embryos during manipulation. |
| Grass stimulator | Grass Instruments | S88 | Stimulators of other kind are also expected to be suitable. |
| Kimwipes, Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 13258179 | – |
| Laser scanning microscope (LSM) | Zeiss | Zeiss LSM 5 Exciter Zeiss LSM 880 |
LSM of other kind are also expected to be suitable. |
| Nunc Cell-Culture Treated, 6-well plate | Thermo Scientific | 140675 | – |
| Objective, 20×/1.0W water immersion | Zeiss | – | – |
| Pasteur Pipette, Graduated 1 mL | Starlab Group | E1414-0100 | – |
| Pasteur Pipette, Micro Fine Tip 1 mL | Starlab Group | E1414-1100 | – |
| Petri dish, 60 mm | Sigma-Aldrich | P5481 | – |
| Plasmid, CMV-Cerulean | Christina L. Hammond (University of Bristol) | pCS2+_cerulean_kanR plasmid injected at 25-75 pg at one-cell stage. Citation: Bussman J, and Schulte-Merker S. (2011) Development 138:4327-4332. doi: 10.1242/dev.068080. | |
| Plasmid, pCS-mCherry-CAAX | Henry Roehl (University of Sheffield) | – | For in vitro transcription using the SP6 promoter (plasmids containing other membrane labelling markers can be used); synthesised capped mRNA to be injected at 100-200 pg at one-cell stage. |
| Pulse Controller | Hoefer Scientific Instruments | PC750 | – |
| Soldering iron | – | – | – |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate/ MS-222; to be dissolved in fish water and used at 0.6 mM. |
| Volocity | Perkin Elmer/Quorum Technologies Inc | – | – |
| Watchmaker forceps, No. 5 | – | – | – |
| Wire, Platinum | Goodfellow | PT005142/12 | 0.40 mm in diameter; an expensive alternative of silver. |
| Wire, Silver | Acros Organics | 317730010 | 0.25 mm in diameter (a range of diameter i.e. 0.25-0.5 mm had been tested, which produced similar results). |
| Zebrafish, myog:H2B-mRFP | David M. Langenau (Massachusetts General Hospital; Harvard Stem Cell Institute) | – | ZFIN official name: Tg(myog:Hsa.HIST1H2BJ-mRFP), fb121Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-160803-2 Citation: Tang Q, Moore JC, Ignatius MS, Tenente IM, Hayes MN, Garcia EG, Torres Yordán N, Bourque C, He S, Blackburn JS, Look AT, Houvras Y, Langenau DM. Imaging tumour cell heterogeneity following cell transplantation into optically clear immune-deficient zebrafish. Nat Commun. 2016 Jan 21;7:10358. doi: 10.1038/ncomms10358. |
| Zebrafish, α-actin:mCherry-CAAX | Peter D. Currrie (ARMI, Monash University) | – | ZFIN official name: Tg(actc1b:mCherry-CAAX), pc22Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-150224-2 Citation: Berger J, Tarakci H, Berger S, Li M, Hall TE, Arner A, and Currie PD. Loss of Tropomodulin4 in the zebrafish mutant träge causes cytoplasmic rod formation and muscle weakness reminiscent of nemaline myopathy. Dis Model Mech. 2014 Dec;7(12):1407-15. doi: 10.1242/dmm.017376. |
| Zebrafish, β-actin:HRAS-EGFP | – | – | ZFIN official name: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP), vu119Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-061107-2 Citation: Cooper MS, Szeto DP, Sommers-Herivel G, Topczewski J, Solnica-Krezel L, Kang HC, Johnson I, and Kimelman D. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Dev Dyn. 2005 Feb;232(2):359-68. doi: 10.1002/dvdy.20252. |
| ZEN software | Zeiss | – | – |
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