Upphandling och decellularisering av råtta bakben med hjälp av en ex vivo perfusionsbaserad bioreaktor för vaskulariserad kompositallotransplantation
Summary
Vi beskriver den kirurgiska tekniken och decellulariseringsprocessen för sammansatta råtta bakben. Decellularisering utförs med användning av natriumdodecylsulfat med låg koncentration genom ett ex vivo-maskinperfusionssystem.
Abstract
Patienter med allvarliga traumatiska skador och vävnadsförlust kräver komplex kirurgisk rekonstruktion. Vaskulariserad sammansatt allotransplantation (VCA) är en utvecklande rekonstruktiv väg för överföring av flera vävnader som en sammansatt underenhet. Trots VCA: s lovande karaktär är de långsiktiga immunsuppressiva kraven en signifikant begränsning på grund av den ökade risken för maligniteter, slutorgantoxicitet och opportunistiska infektioner. Vävnadsteknik av acellulära kompositställningar är ett potentiellt alternativ för att minska behovet av immunsuppression. Häri beskrivs upphandlingen av en råtta bakben och dess efterföljande decellularisering med användning av natriumdodecylsulfat (SDS). Den upphandlingsstrategi som presenteras bygger på den gemensamma lårbensartären. Ett maskinperfusionsbaserat bioreaktorsystem konstruerades och användes för ex vivo-decellularisering av bakbenet. Framgångsrik perfusionsdecellularisering utfördes, vilket resulterade i ett vitt genomskinligt utseende av bakbenet. Ett intakt, perfusable, vaskulärt nätverk i hela bakbenet observerades. Histologiska analyser visade avlägsnande av kärninnehåll och bevarande av vävnadsarkitektur i alla vävnadsfack.
Introduction
VCA är ett framväxande alternativ för patienter som behöver komplex kirurgisk rekonstruktion. Traumatiska skador eller tumörresektioner resulterar i volymetrisk vävnadsförlust som kan vara svår att rekonstruera. VCA erbjuder transplantation av flera vävnader som hud, ben, muskler, nerver och kärl som ett sammansatt transplantat från en givare till en mottagare1. Trots sin lovande natur är VCA begränsad på grund av långsiktiga immunsuppressiva regimer. Livslång användning av sådana läkemedel resulterar i ökad risk för opportunistiska infektioner, maligniteter och slutorgantoxicitet 1,2,3. För att minska och/eller eliminera behovet av immunsuppression visar vävnadstekniska byggnadsställningar som använder decellulariseringsmetoder för VCA stort löfte.
Vävnadsdecellularisering innebär att man behåller den extracellulära matrisstrukturen samtidigt som cellulärt och kärninnehåll avlägsnas. Denna decellulariserade byggnadsställning kan återbefolkas med patientspecifika celler4. Att bevara ECM-nätverket av sammansatta vävnader är dock en extra utmaning. Detta beror på närvaron av flera vävnadstyper med varierande vävnadstäthet, arkitekturer och anatomiska platser inom en byggnadsställning. Detta protokoll erbjuder en kirurgisk teknik och en decellulariseringsmetod för en råtta bakben. Detta är en proof-of-concept-modell för att tillämpa denna vävnadsteknikteknik på sammansatta vävnader. Detta kan också leda till efterföljande ansträngningar för att regenerera sammansatta vävnader genom recellularisering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Råtta bakben är användbara som experimentella modeller i VCA5. Vävnadsteknik av acellulära byggnadsställningar representerar det första steget i att ta itu med bristerna i långsiktiga immunsuppressionsregimer associerade med VCA. Användningen av komposittransplantat utgör en extra utmaning med tanke på närvaron av flera vävnader, var och en med unika funktionella, immunogena och strukturella egenskaper. Detta protokoll visar en framgångsrik metod för att erhålla acellulära sammans…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Figur 3A skapades i BioRender.com.
Materials
| 0.9% Sodium Chloride Injection USP 50 mL | Baxter Corporation | JB1308M | |
| 1 mL Disposable Serological Pipets | VWR | 75816-102 | |
| 10 cc Disposable Syringes | Obtained from Research Institution | ||
| 3-way Stopcock | Obtained from Research Institution | ||
| 5cc Disposable Syringes | Obtained from Research Institution | ||
| 70% Isopropyl Alcohol | Obtained from Research Institution | ||
| Acrodisc Syringe Filter 0.2 µm | VWR | CA28143-310 | |
| Adson Forceps, Straight | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Angiocatheter 24 G 19 mm (¾”) | VWR | 38112 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) 100 mL | Multicell | 450-115-EL | |
| Bone Cutter | Fine Science Tools | 12029-12 | |
| Connectors for 1/16" to 1/8" Tubes | McMasterCarr | 5117K52 | |
| Female Luer to barbed adapter (PVDF) – 1/8" ID | McMasterCarr | 51525K328 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Fine Forceps with Micro-Blunted Tips | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| Heparin Sodium Injection 10,000 IU/10 mL | LEO Pharma Inc. | 006174-09 | |
| Male Luer to barbed adapter (PVDF) – 1/8" ID | McMasterCarr | 51525K322 | |
| Micro Needle Holder | WLorenz | 04-4125 | |
| Microscissors | WLorenz | SP-4506 | |
| Peracetic Acid | Sigma Aldrich | 269336-100ML | |
| Peristaltic Pump, 3-Channel | Cole Parmer | RK-78001-68 | |
| Phosphate Buffered Saline 1x 500 mL | Wisent | 311-425-CL | |
| Povidone Surgical Scrub Solution | Obtained from Research Institution | ||
| Pump Tubing, 3-Stop, Tygon E-LFL | Cole Parmer | RK-96450-40 | |
| Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone | Cole Parmer | RK-96410-16 | |
| Scalpel Blade – #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Handle – #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate Reagent Grade: Purity: >99%, 1 kg | Bioshop | SDS003.1 | |
| Surgical Suture #6-0 | Covidien | VS889 |
Riferimenti
- Kueckelhaus, M., et al. Vascularized composite allotransplantation: Current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration. Transplant International. 29 (6), 655-662 (2016).
- Duisit, J., et al. Bioengineering a human face graft: The matrix of identity. Annals of Surgery. 266 (5), 754-764 (2017).
- Zhang, Q., et al. Decellularized skin/adipose tissue flap matrix for engineering vascularized composite soft tissue flaps. Acta Biomaterialia. 35, 166-184 (2016).
- Londono, R., Gorantla, V. S., Badylak, S. F. Emerging implications for extracellular matrix-based technologies in vascularized composite allotransplantation. Stem Cells International. 2016 (10), 1-16 (2016).
- Fleissig, Y. Y., Beare, J. E., LeBlanc, A. J., Kaufman, C. L. Evolution of the rat hind limb transplant as an experimental model of vascularized composite allotransplantation: Approaches and advantages. SAGE Open Medicine. 8, 205031212096871 (2020).
- Tao, M., et al. Sterilization and disinfection methods for decellularized matrix materials: Review, consideration and proposal. Bioactive Materials. 6 (9), 2927-2945 (2021).
- Chen, Y., Geerts, S., Jaramillo, M., Uygun, B. E. Preparation of decellularized liver scaffolds and recellularized liver grafts. Methods in Molecular Biology. 1577, 255-270 (2018).
- Ahmed, S., Chauhan, V. M., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. New generation of bioreactors that advance extracellular matrix modelling and tissue engineering. Biotechnology Letters. 41 (1), 1-25 (2019).
- Cohen, S., et al. Generation of vascular chimerism within donor organs. Scientific Reports. 11 (1), 13437 (2021).
- Lupon, E., et al. Engineering vascularized composite allografts using natural scaffolds: A systematic review. Tissue Engineering Part B: Reviews. , (2021).
- Urciuolo, A., et al. Decellularised skeletal muscles allow functional muscle regeneration by promoting host cell migration. Scientific Reports. 8 (1), 8398 (2018).
- Jank, B. J., et al. Engineered composite tissue as a bioartificial limb graft. Biomaterials. 61, 246-256 (2015).
