Ensayo de transcitosis de células endoteliales como modelo in vitro para evaluar la permeabilidad de la barrera interna sangre-retina
Summary
Este protocolo ilustra un ensayo de transcitosis de células endoteliales in vitro como modelo para evaluar la permeabilidad de la barrera interna sangre-retina midiendo la capacidad de las células endoteliales microvasculares de la retina humana para transportar peroxidasa de rábano picante a través de las células en procesos de transporte transcelular mediados por caveolas.
Abstract
La disfunción de la barrera hemato-retiniana (BRB) contribuye a la fisiopatología de varias enfermedades oculares vasculares, lo que a menudo resulta en edema retiniano y posterior pérdida de visión. La barrera hemato-retiniana interna (BIB) está compuesta principalmente por endotelio vascular retiniano con baja permeabilidad en condiciones fisiológicas. Esta característica de baja permeabilidad está estrechamente regulada y mantenida por bajas tasas de transporte paracelular entre células endoteliales microvasculares retinianas adyacentes, así como el transporte transcelular (transcitosis) a través de ellas. La evaluación de la permeabilidad de la barrera transcelular retiniana puede proporcionar información fundamental sobre la integridad de iBRB en la salud y la enfermedad. En este estudio, describimos un ensayo de transcitosis de células endoteliales (CE), como un modelo in vitro para evaluar la permeabilidad de iBRB, utilizando células endoteliales microvasculares de la retina humana (HRMEC). Este ensayo evalúa la capacidad de los HRMEC para transportar transferrina y peroxidasa de rábano picante (HRP) en procesos de transporte transcelular mediados por receptores y caveolas, respectivamente. Los HRMEC totalmente confluentes cultivados en membrana porosa se incubaron con transferrina marcada con fluorescencia (transcitosis dependiente de clatrina) o HRP (transcitosis mediada por caveolas) para medir los niveles de transferrina o HRP transferidos a la cámara inferior, indicativos de los niveles de transcitosis a través de la monocapa de CE. La señalización Wnt, una vía conocida que regula iBRB, se moduló para demostrar el método de ensayo de transcitosis basado en HRP mediado por caveolas. El ensayo de transcitosis EC descrito aquí puede proporcionar una herramienta útil para investigar los reguladores moleculares de la permeabilidad EC y la integridad de iBRB en patologías vasculares y para los sistemas de administración de fármacos.
Introduction
La retina humana es uno de los tejidos más exigentes de energía en el cuerpo. El buen funcionamiento de la retina neural requiere un suministro eficiente de oxígeno y nutrientes junto con un flujo restringido de otras moléculas potencialmente dañinas para proteger el ambiente retiniano, que está mediado a través de la barrera hematoretiniana (BRB)1. Similar a la barrera hematoencefálica (BBB) en el sistema nervioso central, el BRB actúa como una barrera selectiva en el ojo, regulando el movimiento de iones, agua, aminoácidos y azúcar dentro y fuera de la retina. BRB también mantiene la homeostasis retiniana y su privilegio inmunológico al prevenir la exposición a factores circulatorios como células inmunes, anticuerpos y patógenos dañinos2. La disfunción BRB contribuye a la fisiopatología de varias enfermedades oculares vasculares, como la retinopatía diabética, la degeneración macular asociada a la edad (DMAE), la retinopatía del prematuro (RP), la oclusión de la vena retiniana y la uveítis, lo que resulta en edema vasogénico y posterior pérdida de visión 3,4,5.
El BRB consiste en dos barreras separadas para dos redes vasculares oculares distintas, respectivamente: la vasculatura retiniana y el coriocapilar fenestrado debajo de la retina. El BRB interno (iBRB) está compuesto principalmente por células endoteliales microvasculares de la retina (RMEC) que recubren la microvasculatura retiniana, que nutre las capas neuronales internas de la retina. Por otro lado, el epitelio pigmentario de la retina forma el componente principal del BRB externo, que se encuentra entre la retina neurosensorial y el coriocapilar2. Para el iBRB, el transporte molecular a través de RMEC tiene lugar a través de rutas paracelulares y transcelulares (Figura 1). El alto grado de selectividad de sustancias a través del iBRB se basa en (i) la presencia de complejos de proteínas de unión que restringen el transporte paracelular entre células endoteliales adyacentes (CE), y (ii) bajos niveles de expresión de mediadores, transportadores y receptores de caveolas dentro de las células endoteliales que mantienen bajas tasas de transporte transcelular 1,6,7,8 . Los complejos de unión que regulan el flujo paracelular están compuestos por uniones estrechas (claudinas, ocludinas), uniones adherentes (cadherinas EV) y uniones gap (conexinas), que permiten el paso de agua y pequeños compuestos solubles en agua. Mientras que las moléculas lipofílicas pequeñas se difunden pasivamente a través del interior de los RMEC, el movimiento de moléculas lipofílicas e hidrófilas más grandes está regulado por vías transendoteliales impulsadas por ATP, incluyendo el transporte vesicular y los transportadores de membrana 5,9.
La transcitosis vesicular se puede clasificar como transcitosis caveolina mediada por caveolina, transcitosis dependiente de clatrina (y mediada por receptores) y macropinocitosis independiente de clatrina (Figura 2). Estos procesos de transporte vesicular involucran vesículas de diferentes tamaños, siendo los macropinosomas los más grandes (que van desde 200-500 nm) y las caveolas las más pequeñas (con un promedio de 50-100 nm), mientras que las vesículas recubiertas de clatrina varían de 70-150 nm10. Las caveolas son invaginaciones de membrana plasmática ricas en lípidos en forma de matraz con una capa de proteína, compuesta principalmente de caveolina-1 que se une al colesterol de la membrana lipídica y otras proteínas estructurales y de señalización a través de su dominio de andamiaje de caveolina11. Las caveolinas trabajan junto con cavina unida periféricamente para promover la estabilización de las caveolas en la membrana plasmática12. Las membranas caveolares también pueden transportar receptores para otras moléculas como insulina, albúmina y lipoproteínas circulantes, incluidas las lipoproteínas de alta densidad (HDL) y las lipoproteínas de baja densidad (LDL) para ayudar a su movimiento a través de las células endoteliales13. Durante el desarrollo, la formación de BRB funcional depende de la supresión de la transcitosis EC8. El endotelio retiniano maduro, por lo tanto, tiene niveles relativamente bajos de caveolas, caveolina-1 y receptores de albúmina con respecto a otras células endoteliales en condiciones fisiológicas, contribuyendo a sus propiedades de barrera 4,9.
Debido a que la descomposición de iBRB es un sello distintivo importante de muchas afecciones oculares patológicas, es esencial desarrollar métodos para evaluar la permeabilidad vascular retiniana in vivo e in vitro. Estos métodos ayudan a proporcionar información probable sobre los mecanismos de la integridad del BRB comprometida y evaluar la eficacia de los posibles objetivos terapéuticos. Las imágenes in vivo actuales o los ensayos cuantitativos de fuga vascular suelen emplear fluorescentes (fluoresceína de sodio y dextrano), colorimétricos (colorante azul de Evans y sustrato de peroxidasa de rábano picante [HRP]) o trazadores radiactivos14 para detectar extravasación de la vasculatura a los tejidos retinianos circundantes con imágenes de microscopio o en lisado tisular aislado. Un trazador ideal para cuantificar la integridad vascular debe ser inerte y lo suficientemente grande como para penetrar libremente los vasos comprometidos mientras están confinados dentro de capilares sanos e intactos. Los métodos que emplean fluoresceína de sodio o dextrano conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC-dextrano) en angiografía con fluoresceína de fondo de ojo vivo (FFA) o montajes planos retinianos aislados se utilizan ampliamente para cuantificar la extravasación retiniana in vivo o ex vivo. FITC-dextrano tiene la ventaja de estar disponible en diferentes pesos moleculares que van desde 4-70 kDa para estudios selectivos de tamaño15,16,17. La FITC-albúmina (~68 kDa) es un trazador alternativo de proteínas de gran tamaño de relevancia biológica para estudios de fugas vasculares18. El colorante Evans Blue, inyectado intracárdicamente19, retroorbitalmente, o a través de la vena de la cola 20, también se basa en su unión con albúmina endógena para formar una molécula grande que puede cuantificarse principalmente mediante detección espectrofotométrica o, menos comúnmente, microscopía de fluorescencia en montajes planos20,21. Sin embargo, estas metodologías cuantitativas o de imágenes de luz a menudo no distinguen el transporte paracelular del transporte transendotelial. Para el análisis específico de la transcitosis con visualización ultraestructural de vesículas transcitadas, se utilizan típicamente moléculas trazadoras como HRP para localizar vesículas transcitadas dentro de las células endoteliales que se pueden observar bajo un microscopio electrónico22,23,24 (Figura 3A-C).
El desarrollo y uso de modelos iBRB in vitro para evaluar la permeabilidad de las células endoteliales podría proporcionar una evaluación robusta y de alto rendimiento para complementar los experimentos in vivo y ayudar a la investigación de reguladores moleculares de la fuga vascular. Los ensayos comúnmente utilizados para evaluar el transporte paracelular y la integridad de las uniones estrechas incluyen la resistencia eléctrica transendotelial (TEER), una medida de conductancia iónica (Figura 4)2,25, y el ensayo de fuga vascular in vitro utilizando trazadores fluorescentes de peso molecular pequeño26. Además, se han utilizado ensayos de transcitosis basados en transferrina que modelan la BHE para explorar la transcitosis dependiente de clatrina27. A pesar de esto, los ensayos para evaluar BRB y, más específicamente, la transcitosis caveolar retiniana EC in vitro son limitados.
En este estudio, describimos un ensayo de transcitosis EC utilizando células endoteliales microvasculares de la retina humana (HRMEC) como modelo in vitro para determinar la permeabilidad iBRB y la transcitosis EC. Este ensayo se basa en la capacidad de los HRMEC para transportar transferrina o HRP a través de las vías de transcitosis mediadas por receptores o dependientes de caveolas, respectivamente (Figura 2). Los HRMEC cultivados a confluencia completa en la cámara apical (es decir, inserto de filtro) se incubaron con transferrina conjugada fluorescente (Cy3-Tf) o HRP para medir la intensidad de fluorescencia correspondiente a los niveles de transferrina o HRP transferidos a la cámara inferior a través de la transcitosis EC únicamente. La confluencia de la monocapa celular puede confirmarse midiendo TEER, indicando la integridad de la unión estrecha25. Para demostrar la técnica de ensayo TEER y transcitosis, se utilizaron moduladores moleculares conocidos de la permeabilidad vascular y la transcitosis CE, incluyendo el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)28 y los de señalización Wnt (ligandos Wnt: Wnt3a y Norrin)29.
Protocol
Representative Results
Discussion
BRB juega un papel esencial en la salud y la enfermedad de la retina. Las técnicas in vitro que evalúan la permeabilidad vascular han demostrado ser herramientas cruciales en los estudios relacionados con el desarrollo y la función de la barrera (BRB/BBB). El procedimiento descrito aquí podría utilizarse para estudiar los mecanismos moleculares subyacentes a la transcitosis EC o evaluar los moduladores moleculares relacionados que afectan la permeabilidad del BRB. In vitro Los ensayos de transcitos…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los NIH (R01 EY028100, EY024963 y EY031765) a JC. ZW fue apoyado por una Beca de Iniciación de Carrera de la Fundación del Ojo de los Caballeros Templarios.
Materials
| Biological Safety Cabinet | Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific | 1286 | |
| Cell culture petridish | Nest Biotechnology | 704001 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Centrifuge tubes (15 mL) | Corning Inc. | 352097 | |
| Centrifuge tubes (50 mL) | Denville Scientific Inc. | C1062-P | |
| Cyanine 3-human Transferrin | Jackson ImmunoResearch | AB_2337082 | |
| Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2) | Lonza Bioscience | CC-3156 | |
| Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) SingleQuots supplements | Lonza Bioscience | CC-4176 | |
| EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2) | Millipore | MERS00002 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Lonza Bioscience | CC-4102B | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Hemocytometer (2-chip) | Bulldog Bio | DHC-N002 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) | Sigma-Aldrich | P8250 | |
| Human retinal microvascular endothelial cells (HRMEC) | Cell Systems | ACBRI 181 | |
| Incubator | Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific | 3110 | |
| L cells (for Control-conditioned medium) | ATCC | CRL-2648 | |
| L Wnt-3A cells (for Wnt3A-conditioned medium) | ATCC | CRL-2647 | |
| Light microscope | Leica | DMi1 | |
| Multimode Plate Reader | EnSight, PerkinElmer | ||
| Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (1x) | GIBCO | 10010-023 | |
| QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate kit | Thermo Fisher Scientific | 15169 | |
| Recombinant human Norrin (rhNorrin) | R&D Systems | 3014-NR | |
| Recombinant human Vascular endothelial growth factor (rhVEGF) | R&D Systems | 293-VE | |
| Syringe filter (0.22 µm) | Millipore | SLGP033RS | |
| Transwell inserts (6.5 mm transwell, 0.4 µm pore polyester membrane insert) | Corning Inc. | CLS3470-48EA | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) (1x) | GIBCO | 25-200-072 | |
| Water bath | Precision, Thermo Fisher Scientific | 51221060 | |
| XAV939 (Wnt/β-catenin Inhibitor) | Selleckchem | S1180 |
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