Den nåværende protokollen beskriver en metode for immunmerking av et protein i hjertevevsseksjonene ved hjelp av kvanteprikker. Denne teknikken gir et nyttig verktøy for å visualisere ethvert proteins subcellulære lokalisering og uttrykk på ultrastrukturelt nivå.
Den subcellulære lokaliseringen er avgjørende for å avgrense riktig funksjon og bestemme molekylære mekanismer for et bestemt protein. Flere kvalitative og kvantitative teknikker brukes til å bestemme subcellulær lokalisering av proteiner. En av de nye teknikkene for å bestemme den subcellulære lokaliseringen av et protein er kvanteprikker (QD) -mediert immunmerking av et protein etterfulgt av avbildning av dem med transmisjonselektronmikroskopi (TEM). QD er en halvleder nanokrystall med en dobbel egenskap av krystallinsk struktur og høy elektrondensitet, noe som gjør dem anvendelige for elektronmikroskopi. Denne nåværende metoden visualiserte den subcellulære lokaliseringen av Sigma 1-reseptor (Sigmar1) protein ved bruk av QD-TEM i hjertevevet på ultrastrukturelt nivå. Små kuber av hjertevevsseksjonene fra en villtype mus ble festet i 3% glutaraldehyd, deretter osmicated, farget med uranylacetat, etterfulgt av sekvensiell dehydrering med etanol og aceton. Disse dehydrerte hjertevevsseksjonene ble innebygd i epoksyharpikser med lav viskositet, kuttet i tynne seksjoner med 500 nm tykkelse, satt på rutenettet og deretter utsatt for antigenavmaskering med 5% natriummetaperiodat, etterfulgt av slukking av gjenværende aldehyder med glycin. Vevene ble blokkert, etterfulgt av sekvensiell inkubasjon i primært antistoff, biotinylert sekundært antistoff og streptavidinkonjugert QD. Disse flekkete seksjonene ble flekktørket og avbildet ved høy forstørrelse ved hjelp av TEM. QD-TEM-teknikken tillot visualisering av Sigmar1-proteinets subcellulære lokalisering på ultrastrukturelt nivå i hjertet. Disse teknikkene kan brukes til å visualisere tilstedeværelsen av noe protein og subcellulær lokalisering i et hvilket som helst organsystem.
Menneskekroppen består av mange proteiner som er ansvarlige for mange kroppsfunksjoner. Funksjonen av proteiner er i stor grad avhengig av lokalisering i orgel og cellulære organeller. Flere teknikker, inkludert subcellulær fraksjonering, immunfluorescens og vaskemiddelmediert proteinekstraksjon, brukes ofte til å bestemme proteinets subcellulære lokalisering 1,2. Mikroskopi ved bruk av immunfluorescerende fargestoff er den mest brukte metoden blant disse teknikkene. Imidlertid er de fluorescerende fargestoffene som brukes i denne teknikken mindre stabile og utsatt for fotobleking3. Andre teknikker involverte høyoppløselig mikroskopi for å visualisere proteinet på et ultrastrukturelt nivå ved å immunmerke proteiner med elektrontette, tungmetaller (gull, ferritin) eller kvanteprikker nanokrystaller og etterfulgt av å visualisere dem ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi (TEM) 4,5.
QD er en halvleder nanokrystall sammensatt av halvledermetallforbindelser med kontrollerbare fotoluminescensegenskaper som har stor betydning i biologiske systemer3. QD nanokrystaller er laget i et kjerneskallformat hvor en nanokrystall er innkapslet i dannelsen av nanokrystaller for å sikre riktig stabilitet og funksjon. Vanlig brukt kjerne-skall nanokrystaller kombinasjon er CdSe / ZnS, CdSe / CdS CdSe / ZnSe, CdTe / CdS, CdTe / ZnS og CdTe / CdS / ZnS (core / shell / shell) 3. Blant disse nanokrystallkombinasjonene studeres CdSe / ZnS og CdSe / CdS mest kraftig og brukes ofte som sekundære antistoffkonjugater 3,6. Disse QD-nanopartiklene har også fluorescerende egenskaper med forskjellige eksitasjons- og utslippsspektra enn tradisjonelle fluoroforer. QD benytter eksitering av elektroner fra bulkvalensbåndet for å vise høyere fluorescenskvanteutbytter sammenlignet med tradisjonelle fluoroforer. Nanokrystallarrangementet av halvledermetaller gjør QD-mediert merking mer stabil og motstandsdyktig mot fotobleking6. I tillegg tillater nanokrystallkjernen i QD og dens krystallinske struktur QD av forskjellige størrelser å ha et bredt spekter av absorpsjonsspektra og svært smale utslippstopper7. Videre er disse QD-partiklene store nok til å gi høy elektrondensitet, noe som gjør dem nyttige i høyoppløselige mikroskopiteknikker, inkludert transmisjonselektronmikroskopi 5,8,9. Disse QD nanokrystaller er også kommersielt tilgjengelige i flere størrelser med forskjellige fluorescensutslippsspektra og former, noe som gjør dem til en god kandidat for merking med flere antistoffer10,11.
QD-teknologi fikk stor betydning i biologisk forskning på grunn av flere funksjonelle egenskaper, inkludert bruk i levende celleavbildning, studiet av transportmekanismer i cellen, membrantransport av proteinets diffusjonsbevegelse, funksjonell heterogenitet av celler og merking av intracellulær organell 3,12,13,14,15,16 . QD er også nyttig i molekylær diagnostikk for å målrette og oppdage kreftvev, karakterisere svulstens molekylære profil og immunstatus, og visualisere glasslegeme og epiretinale membraner 3,17,18. I tillegg kan QD også brukes i medisinske terapier for å behandle tumormaligniteter via fotodynamisk terapi og oftalmiske anomalier ved å levere medisiner til øynene 3,17,18,19.
Ved hjelp av disse svært nyttige QD-nanokrystallene bestemte denne studien den subcellulære lokaliseringen av et protein som heter Sigma 1-reseptor (Sigmar1). Sigmar1 er et allestedsnærværende uttrykt multi-tasking molekylært chaperone protein. Omfattende studier med fokus på Sigmar1s subcellulære lokalisering i forskjellige vev og organer rapporterte en celle- og vevstypespesifikk subcellulær lokalisering som fremkalte molekylær funksjon20. I forskjellige celler (nevron-, fotoreseptor- og immunceller) og vev (lever og hjerne) ved hjelp av forskjellige biokjemiske tilnærminger, rapporterte studier lokalisering av Sigmar1 på endoplasmatisk retikulum (ER), mitokondrierassosiert ER-membran (MAM), nukleær konvolutt, plasmamembran, nukleoplasmisk retikulum, kjerne og mitokondrier. Til tross for alle disse studiene forble den subcellulære lokaliseringen av Sigmar1 i hjertet ukjent20. Derfor ble den subcellulære lokaliseringen av Sigmar1 i hjertevev bestemt ved hjelp av QD-mediert immunmerking etterfulgt av TEM-avbildning.
I denne studien ble QD-mediert immunmerking brukt for å tydelig vise subcellulær lokalisering av Sigmar1. Ved hjelp av QD ble Sigmar1s lokalisering på mitokondriell membran, spesielt den indre mitokondrielle membranen, avbildet i hjertevev. I tillegg ble Sigmar1 også funnet å være lokalisert på sarkoplasmatisk / endoplasmatisk retikulum (S / ER) og lysosomer på ultrastrukturelt nivå, som vist i figur 2A-D.
Et kritisk trinn i denne protokollen er etsnings- eller antigenavmaskeringstrinnet ved bruk av høykonsentrert natriummetaperiodatløsning for å avdekke antigenet etter glutaraldehydfiksering og osmication. Denne protokollen brukte en enkelt behandling med høy konsentrasjon (5%) natriummetaperiodat i 30 minutter ved romtemperatur. Ekstra forsiktighet er nødvendig i dette trinnet, da en lengre varighet eller høyere konsentrasjon for natriummetaperiodatinkubasjon vil resultere i aggregering av strukturer, tap av membrandefinisjon for organeller og forårsake perforeringer i seksjonen, noe som gjør det vanskelig å visualisere proteinet eller strukturen. Alternativt kan en lavere konsentrasjon av (3%) metaperiodatoppløsning i to trinn i 30 minutter også brukes i stedet for 5% metaperiodat. Studier har vist at dette alternativet viser lignende resultater som med 5% metaperiodatløsning for ett-trinns 30 min inkubasjon. Imidlertid gir en 3% metaperiodatløsning i 30 minutter inkubasjon i to ganger bedre kontroll over prosessen26,27,28. I utgangspunktet brukte denne protokollen inkubasjon av seksjonene med 10% metaperiodatløsning i 30 minutter. På grunn av for mange perforeringer opprettet i vevsseksjonen ved denne konsentrasjonen, ble imidlertid den endelige konsentrasjonen og inkubasjonsvarigheten av metaperiodatløsningen avsmalnet og optimalisert til 5% i 30 minutter.
Et annet trinn krevde optimalisering av fikseringstiden med glutaraldehyd. Suboptimal fiksering av vev resulterer i utilstrekkelig QD-merking, mens overfiksering av vev resulterer i høyere ikke-spesifikk merking. Derfor må det vurderes nøye ved bestemmelse og titrering av et optimalt nivå av vevsfiksering for riktig og spesifikk merking av proteiner. Ved bruk av hjertevev ble fikseringstiden med glutaraldehyd titrert med 24 timer og 48 timer som tidspunkter. Basert på fargebildene av seksjonene som ble fikset for begge tidspunktene, ble det funnet at seksjoner festet i 24 timer viste bedre resultater. Til dags dato er QD nanokrystaller tilgjengelige i flere størrelser, inkludert 525, 565, 585, 605, 655 og 705 nm11,29. Hver av disse QD har sine egne utslippsspektra og avgir fluorescens ved forskjellige bølgelengder. I tillegg viser disse kommersielt tilgjengelige QD-ene i forskjellige størrelser forskjellige former; for eksempel er QD 525, 565 og 585 praktisk talt sfæriske med forskjellige størrelser, mens QD 605, 655 og 705 er uregelmessig avlang formet. Av disse forskjellige QD nanokrystallene er QD 525, 565 og 655 lett å skille fra hverandre11,29. Disse forskjellene i utslippsspektra og former gjør QD til en god kandidat for multi-merking av proteiner og visualisering ved fluorescens og elektronmikroskopi. I denne studien ble en kommersielt tilgjengelig QD, QD 655, brukt til å merke Sigmar1-proteinet for å skille det fra en hvilken som helst ikke-spesifikk bakgrunn i de fargede seksjonene.
Et annet motstykke til QD for proteinmerking i høyoppløselig mikroskopi er immunogoldpartikkelen. Immunogoldpartiklene brukes tradisjonelt til å merke proteiner for høyoppløselig mikroskopi. Disse gullpartiklene er svært elektrontette og lett identifiserbare sammenlignet med QD nanokrystaller. QD viser imidlertid bedre effektivitet med bedre penetrasjon i vev, høyere stabilitet og holdbarhet, og bedre oppbevaring av ultrastrukturelle komponenter, noe som gjør dem til en bedre kandidat for proteinmerking 4,5. QD har også en unik evne til å bli oppdaget av både lys- og elektronmikroskopi, noe som legger til verdien over immunogold-merking10.
En begrensning av denne QD-medierte immunmerkingen er bruken av osmiumtetroksid under behandlingen. Osmiumtetroksid brukes til å øke elektrontettheten, ledningsevnen og kontrasten til ellers mindre elektrontette og mindre kontrasterende biologiske membranstrukturer 5,30. Imidlertid ødelegger bruken av osmiumtetroksid øyeblikkelig og irreversibelt egenskapen til prøven for å skape fluorescens når den er merket med QD6. Dette begrenser bruken av QD i fluorescensmikroskopi. En alternativ tilnærming som utelater bruken av osmiumtetroksid vil være fordelaktig for å beholde de fluorescerende egenskapene og dermed den doble anvendelsen av QD-mediert immunmerking. Noen av de nyere modellene av TEM har muligheten til å feste Energy Dispersive X-Ray Analysis (EDX) -systemet som gjør det mulig å identifisere materialets elementære sammensetning. En annen begrensning av studien er mangelen på elementær kartlegging av en prøve og bildeanalyse ved hjelp av EDX. Derfor bør fremtidige studier fokusere på EDX-analysen av QD-spektrene for å analysere elementær sammensetning.
QD-merking av proteiner har fått mye oppmerksomhet i nyere tid. QD tilbyr flere applikasjoner og fordeler i både biologisk forskning og medisinsk terapi. QD er i tillegg innpakket med polydentatligand utviser økt stabilitet som opprettholder kvanteutbyttet. Videre øker innkapslingen av QD med disse bio-gunstige midlene også biotilgjengeligheten i vev, noe som gjør den til en god kandidat for potensiell anvendelse ved påvisning av svulster, levende cellebilder, legemiddellevering og vevsavbildning 3,31,32.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health-tilskudd: R01HL145753, R01HL145753-01S1, R01HL145753-03S1 og R01HL152723; LSUHSC-S CCDS Finish Line Award, COVID-19 Research Award og LARC Research Award til MSB; LSUHSC-S Malcolm Feist Kardiovaskulær og AHA Postdoktorstipend til CSA (20POST35210789); og LSUHSC-S Malcolm Feist Pre-doctoral Fellowship til RA.
200 Mesh copper grid | Ted Pella | G200HH | |
6-month-old male mice with FVB/N background | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | ||
Acetone 100% | Fisher Chemicals | A949 | |
Antibody diluent | Dako | S3022 | |
anti-Sigmar1 antibody | Cell Signaling | 61994S | |
Biotinylated goat anti-rabbit IgG antibody | Sigma Aldrich | B7389 | |
BSAc (10%) | Electron Microscopy Sciences | 25557 | |
Calcium chloride | Sigma Aldrich | C7902 | |
Cytoseal Xyl | Thermo fisher | 8312-4 | |
DER 732C36AA10:C33 | Electron Microscopy Sciences | 13010 | |
Dextrose | Sigma Aldrich | G7528 | |
Diamond Knife | Diatome | Histo; Ultra 450 | |
DMAE | Electron Microscopy Sciences | 13300 | |
Electron microscope | JEOL | JEOL-1400 Flash | |
ERL 4221 | Electron Microscopy Sciences | 15004 | |
Ethanol 100% | Fisher Chemicals | A405P | |
Glutaraldehyde 3% | Electron Microscopy Sciences | 16538-15 | |
Glycine | Alfa Aesar | A13816 | |
Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA56 | |
Micromolds | Ted Pella | 10505 | |
Microtome | Leica Microsystem | EM UC7 | |
Normal goat serum | Invitrogen | PCN5000 | |
NSA | Electron Microscopy Sciences | 19050 | |
Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19150 | |
Parafilm | Genesse Scientific | 16-101 | |
Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P5655 | |
Potassium Phosphate monobasic | Sigma Aldrich | 71640 | |
Qdot 655 Streptavidin Conjugate | Invitrogen | Q10121MP | |
Sodium Acetate | Fisher Scientific | BP334 | |
Sodium Cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358 | |
Sodium metaperiodate | Sigma Aldrich | 71859 | |
Sodium Phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P9541 | |
Surgical blade (size 10) | Aspen surgical | 371110 | |
TEM image software | AMT-V700 | AMT TEM imaging systems | |
TEM imaging camera | XR80 TEM series | AMT TEM imaging systems | |
Toluidine Blue O solution (0.5%) | Fisher Scientic | S25612 | |
Uranyl acetate | Polysciences | 21447 |