Trapianto cardiaco cervicale eterotopico di topo utilizzando bracciali vascolari
Summary
I modelli di trapianto cardiaco murino rappresentano preziosi strumenti di ricerca per lo studio dell’immunologia dei trapianti. Il presente protocollo descrive il trapianto cardiaco cervicale eterotopico di topo che prevede il posizionamento di polsini sull’arteria carotide comune del ricevente e sul tronco dell’arteria polmonare del donatore per consentire il flusso sanguigno laminare.
Abstract
I modelli murini di trapianto cardiaco sono frequentemente utilizzati per studiare il danno da ischemia-riperfusione, le risposte immunitarie innate e adattative dopo il trapianto e l’impatto delle terapie immunomodulatorie sul rigetto del trapianto. Il trapianto di cuore cervicale eterotopico nei topi è stato descritto per la prima volta nel 1991 utilizzando anastomosi suturate e successivamente modificato per includere tecniche di bracciale. Questa modifica ha permesso di migliorare le percentuali di successo e, da allora, ci sono stati più rapporti che hanno proposto ulteriori miglioramenti tecnici. Tuttavia, la traduzione in un utilizzo più diffuso rimane limitata a causa della difficoltà tecnica associata alle anastomosi dell’innesto, che richiede precisione per ottenere una lunghezza e un calibro adeguati dei polsini per evitare torsioni anastomotiche vascolari o tensione eccessiva, che possono causare danni all’innesto. Il presente protocollo descrive una tecnica modificata per l’esecuzione di trapianto cardiaco cervicale eterotopico nei topi che prevede il posizionamento del bracciale sull’arteria carotide comune del ricevente e sull’arteria polmonare del donatore in allineamento con la direzione del flusso sanguigno.
Introduction
Abbott et al. hanno pubblicato1 la prima descrizione del trapianto di cuore addominale eterotopico nei ratti nel 1964. Queste tecniche chirurgiche sono state perfezionate e semplificate da Ono et al. nel 19692. Corry et al. hanno descritto per la prima volta un metodo per il trapianto di cuore addominale eterotopico nei topi nel 1973; Analogamente ai modelli di ratto precedentemente riportati, ciò ha comportato l’attecchimento nell’addome dell’ospite con rivascolarizzazione mediante anastomosi end-to-side dell’arteria polmonare del donatore e dell’aorta ascendente alla vena cava inferiore e all’aorta addominale del ricevente, rispettivamente3. Il trapianto eterotopico di cuore cervicale nei ratti è stato descritto da Heron nel 1971 utilizzando polsini in teflon costituiti da cateteri endovenosi da 16 G (diametro esterno 1,6 mm)4. Chen5 e Matsuura et al.6 hanno successivamente riportato il trapianto di cuore cervicale eterotopico nei topi nel 1991, le cui tecniche differivano principalmente nel loro metodo di ri-anastomosi. L’approccio di Chen prevedeva anastomosi suturate dell’aorta ascendente del donatore all’arteria carotide del ricevente e dell’arteria polmonare del donatore alla vena giugulare esterna del ricevente5. A causa delle avanzate competenze tecniche richieste per queste anastomosi suturate microchirurgiche, è stata necessaria una notevole quantità di tempo ed esperienza per ottenere un alto tasso di successo. Matsuura et al. hanno descritto un metodo che utilizza una tecnica di bracciale senza sutura, simile a quella usata da Heron, che prevedeva anastomosi end-to-end usando il posizionamento extra-luminale dei polsini. Ha modellato polsini in teflon da 22 G (diametro esterno 0,8 mm) e 24 G (diametro esterno 0,67 mm) cateteri endovenosi e li ha posizionati sulla vena giugulare esterna del ricevente e sull’arteria carotide comune, rispettivamente6. Questi polsini sono stati quindi posizionati all’interno dell’arteria polmonare e dell’aorta del donatore e fissati legando una legatura di sutura attorno alla connessione. Questo approccio si è tradotto in un migliore tasso di successo. Ancora più importante, ha comportato una riduzione del tempo necessario per completare entrambe le anastomosi cervicali, riducendo così il tempo ischemico caldo dell’innesto a meno di un terzo di quello che utilizza il metodo di sutura addominale. Inoltre, poiché i polsini sono posizionati attorno alla superficie esterna della nave, non vi è alcun corpo estraneo esposto al lume del vaso, il che riduce in gran parte la possibilità di trombosi dopo l’intervento chirurgico7. Nel frattempo, l’utilizzo della tecnica del bracciale fornisce supporto intorno ai vasi nel sito dell’anastomosi senza richiedere alcuna sutura, il che riduce il rischio di sanguinamento dopo la rivascolarizzazione6.
Sono state proposte numerose revisioni di questa tecnica. Per adattarsi alla breve lunghezza dell’arteria carotide comune del topo (circa 5 mm), Tomita et al.8 hanno sviluppato una modifica di questa tecnica con un bracciale arterioso più piccolo (diametro esterno di 0,6 mm) omettendo invece di tenere le suture e tirare l’arteria direttamente attraverso il bracciale con una pinza fine. Wang et al. hanno ulteriormente semplificato questo approccio posizionando bracciali da 22 G e 24 G sull’arteria polmonare destra del donatore e sull’arteria carotide comune destra del ricevente, rispettivamente9. Vari rapporti hanno descritto modifiche a questi approcci, tra cui l’uso di bracciali specializzati, morsetti microchirurgici, dilatatori dei vasi e cardioplegia10,11,12. In particolare, tutti questi metodi comportano la circolazione retrograda del sangue attraverso il cuore, con il sangue che scorre dall’arteria carotide comune ricevente all’aorta del donatore, alle arterie coronarie, al seno coronarico, quindi si svuota nell’atrio destro ed esce dall’arteria polmonare nella vena giugulare esterna ricevente.
Rispetto all’attecchimento nell’addome, il trapianto cardiaco cervicale offre molteplici vantaggi. Come accennato in precedenza, l’esposizione cervicale consente una rivascolarizzazione più rapida e tempi ischemici caldi più brevi6. Il metodo cervicale è anche meno invasivo ed è associato a tempi di recupero postoperatorio più brevi in quanto evita una laparotomia6. È importante sottolineare che le anastomosi end-to-end con bracciali possono essere eseguite invece di anastomosi end-to-side, il che riduce il rischio di complicanze come il sanguinamento anastomotico. L’approccio addominale comporta anche un aumentato rischio di sviluppare complicanze trombotiche nell’aorta addominale o nella vena cava inferiore, portando a ischemia del midollo spinale e paralisi degli arti posteriori. La posizione cervicale superficiale del trapianto consente un facile accesso alla valutazione della vitalità dell’innesto mediante palpazione, elettrocardiografia e imaging invasivo o non invasivo. Sebbene gli innesti cervicali riprendano l’attività cardiaca spontanea dopo la riperfusione, non impattano significativamente sui parametri sistolici e diastolici del ricevente. Questo modello fornisce informazioni preziose per studiare le risposte cellulari dopo il trapianto, come il danno da ischemia-riperfusione e il rigetto del trapianto. Inoltre, questo modello offre un approccio ideale per consentire l’imaging post-trapianto, come la microscopia intravitale a due fotoni o la tomografia a emissione di positroni (PET). A tal fine, il nostro laboratorio ha precedentemente riportato metodi per visualizzare tessuti e organi in movimento nel topo, tra cui il battito di cuori murini e innesti di arco aortico dopo trapianto cervicale eterotopico per visualizzare il traffico leucocitario durante la lesione da ischemia-riperfusione e all’interno delle placche aterosclerotiche, rispettivamente13,14,15 . Inoltre, grazie alla sua posizione superficiale e alla facilità di esposizione, questo modello è adatto per il retrapianto cardiaco16.
Questo rapporto descrive una tecnica che consente il flusso sanguigno laminare con il posizionamento esterno dei polsini vascolari sui vasi da cui proviene il flusso sanguigno. Ciò consente una transizione graduale del flusso sanguigno da un vaso all’altro, evitando l’esposizione del bordo distale del vaso nel lume vascolare. Inoltre, la tecnica utilizza un bracciale più grande da 20 G, invece dei polsini da 22 G precedentemente utilizzati, per l’arteria polmonare del donatore per garantire un ampio ritorno del flusso sanguigno al ricevente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Utilizzando questa tecnica, il trapianto cardiaco cervicale eterotopico di topo può essere eseguito in meno di 40 minuti da un microchirurgo esperto e in circa 60 minuti da un microchirurgo entry-level. Mentre il trapianto di cuore cervicale è stato studiato in numerosi modelli animali, un modello murino rimane il gold standard a causa di molteplici ceppi genetici ben definiti, capacità di alterazione genetica e disponibilità di numerosi reagenti, inclusi gli anticorpi monoclonali24. La tecnic…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DK è supportato dalle sovvenzioni del National Institutes of Health 1P01AI116501, R01HL094601, R01HL151078, dalla sovvenzione Veterans Administration Merit Review 1I01BX002730 e dalla Fondazione per il Barnes-Jewish Hospital.
Materials
| 6-0 braided silk ties | Henry Schein Inc | 7718729 | |
| 0.75% Providone iosine scrub | Priority Care Inc | NDC 57319-327-0 | |
| 10-0 nylon suture | Surgical Specialties Corporation | AK-0106 | |
| 655-nm nontargeted Q-dots | Invitrogen | Q21021MP | |
| 70% Ethanol | Pharmco Products Inc | 111000140 | |
| 8-0 braided silk ties | Henry Schein Inc | 1005597 | |
| Adson forceps | Fine Science Tools Inc | 91127-12 | |
| BALB/c and C57BL/6 mice (6-8 weeks) | Jackson Laboratories | ||
| Bipolar coagulator | Valleylab Inc | SurgII-20, E6008/E6008B | |
| Carprofen (Rimadyl) injection | Transpharm | 35844 | |
| Carprofen (Rimadyl) oral chewable tablet | Transpharm | 38995/37919 | |
| Custom-built 2P microscope running ImageWarp acquisition software | A&B Software | ||
| Dumont no. 5 forceps | Fine Science Tools Inc | 11251-20 | |
| Fine vannas style spring scissors | Fine Science Tools Inc | 15000-03 | |
| GraphPad Prism 5.0 | Sun Microsystems Inc. | ||
| Halsey needle holder | Fine Science Tools Inc | 91201-13 | |
| Halsted-Mosquito clamp curved tip | Fine Science Tools Inc | 91309-12 | |
| Harvard Apparatus mouse ventilator model 687 | Harvard Apparatus | MA1 55-0001 | |
| Heparin solution (100 U/mL) | Abraxis Pharmaceutical Products | 504031 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Ketamine (50 mg/kg) | Wyeth | 206205-01 | |
| Microscope—Leica Wild M651 × 6–40 magnification | Leica Microsystems | ||
| Moria extra fine spring scissors | Fine Science Tools Inc | 15396-00 | |
| Ohio isoflurane vaporizer | Parkland Scientific | V3000i | |
| Qdots | ThermoFisher | 1604036 | |
| S&T SuperGrip Forceps angled tip | Fine Science Tools Inc | 00649-11 | |
| S&T SuperGrip Forceps straight tip | Fine Science Tools Inc | 00632-11 | |
| Sterile normal saline (0.9% (wt/vol) sodium chloride | Hospira Inc | NDC 0409-4888-20 | |
| Sterile Q-tips (tapered mini cotton tipped 3-inch applicators) | Puritan Medical Company LLC | 823-WC | |
| Surflow 20 gauge 1/4-inch Teflon angiocatheter | Terumo Medical Corporation | SR-OX2032CA | |
| Surflow 24 gauge 3/4-inch Teflon angiocatheter | Terumo Medical Corporation | R-OX2419CA | |
| ThermoCare Small Animal ICU System (recovery settings 3 L/min O2, 80 °C, 40% humidity) | Thermocare Inc | ||
| VetBond | Santa Cruz Biotechnology SC361931 | NC0846393 | |
| Xylazine (10 mg/kg) | Lloyd Laboratories | 139-236 |
Riferimenti
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