Suplementación lipídica para la longevidad y análisis transcripcional de genes en Caenorhabditis elegans
Summary
El presente protocolo describe métodos de suplementación lipídica en cultivos líquidos y en placa para Caenorhabditis elegans, junto con estudios longitudinales y análisis transcripcionales de genes a granel o unos pocos gusanos y tejidos de gusanos.
Abstract
El envejecimiento es un proceso complejo caracterizado por cambios fisiológicos progresivos resultantes de contribuciones ambientales y genéticas. Los lípidos son cruciales para constituir componentes estructurales de las membranas celulares, almacenar energía y como moléculas de señalización. La regulación del metabolismo lipídico y la señalización es esencial para activar distintas vías de longevidad. El gusano redondo Caenorhabditis elegans es un organismo excelente y poderoso para diseccionar la contribución del metabolismo lipídico y la señalización en la regulación de la longevidad. Múltiples estudios de investigación han descrito cómo la suplementación dietética de moléculas lipídicas específicas puede extender la vida útil de C. elegans ; Sin embargo, las diferencias menores en las condiciones de suplementación pueden causar problemas de reproducibilidad entre los científicos en diferentes laboratorios. Aquí, se informan dos métodos detallados de suplementación para C. elegans que emplean suplementos de lípidos con bacterias sembradas en placas o suspensión bacteriana en cultivo líquido. También se proporcionan aquí los detalles para realizar ensayos de vida útil con suplementos lipídicos de por vida y análisis qRT-PCR utilizando un lisado de gusanos enteros o tejidos disecados derivados de unos pocos gusanos. Utilizando una combinación de estudios longitudinales e investigaciones transcripcionales sobre la suplementación con lípidos, los ensayos de alimentación proporcionan enfoques confiables para diseccionar cómo los lípidos influyen en la longevidad y el envejecimiento saludable. Esta metodología también se puede adaptar para varios enfoques de detección nutricional para evaluar los cambios en un subconjunto de transcripciones utilizando un pequeño número de tejidos disecados o unos pocos animales.
Introduction
Lípidos
Los lípidos son pequeñas moléculas hidrofóbicas o anfipáticas solubles en disolventes orgánicos pero insolubles en agua 1,2. Las distintas moléculas lipídicas se diferencian entre sí en función del número de carbonos contenidos en sus cadenas, ubicación, número de dobles enlaces y estructuras unidas, incluidos el glicerol o los fosfatos. Los lípidos desempeñan un papel crucial dentro y a través de distintas células para regular las funciones del organismo, incluida la constitución de bicapas de membrana, el almacenamiento de energía y la actuación como moléculas de señalización 3,4.
En primer lugar, los lípidos son componentes estructurales de las membranas biológicas, incluyendo la membrana plasmática y las membranas subcelulares intracelulares que dividen los compartimentos internos del entorno extracelular. En segundo lugar, los lípidos son la principal forma de almacenamiento de energía en animales vertebrados e invertebrados. Los lípidos neutros, incluidos los triacilgliceroles, se almacenan durante un período prolongado en varios tejidos, incluido el tejido adiposo. En el nematodo Caenorhabditis elegans, el intestino es el principal órgano metabólico de almacenamiento de grasa; Su función no solo está involucrada en la digestión y absorción de nutrientes, sino también en el proceso de desintoxicación, que se asemeja a la actividad de los hepatocitos de mamíferos. Otros tejidos de almacenamiento de grasa incluyen la línea germinal, en la que los lípidos son esenciales para el desarrollo de ovocitos, y la hipodermis, que está compuesta por células epidérmicas similares a la piel 3,5. En tercer lugar, en los últimos años, más evidencia ha sugerido que los lípidos son poderosas moléculas de señalización involucradas en la señalización intra y extracelular al actuar directamente sobre una variedad de receptores, incluidos los receptores nucleares y acoplados a proteínas G, o indirectamente a través de la modulación de la fluidez de la membrana o modificaciones postraduccionales 6,7,8,9 . Otros estudios continuarán dilucidando los mecanismos moleculares subyacentes de la señalización lipídica en la promoción de la longevidad y la salud.
Los organismos modelo son importantes para abordar cuestiones biológicas específicas que son demasiado complejas para estudiarlas en humanos. Por ejemplo, el gusano redondo C. elegans es un excelente modelo para realizar análisis genéticos para diseccionar procesos biológicos relevantes para la nutrición humana y la enfermedad10. Las vías moleculares altamente conservadas relevantes para la fisiología humana, los tejidos complejos, los patrones de comportamiento y las abundantes herramientas de manipulación genética hacen de C. elegans un organismo modelo notable11. Por ejemplo, C. elegans es excelente en el envío de pantallas genéticas para identificar genes específicos del fenotipo, así como en pantallas genéticas inversas de todo el genoma a través de la interferencia de ARN12.
En los laboratorios, los nematodos se cultivan en placas de Petri de agar sembradas con un césped de bacterias Escherichia coli, proporcionando macronutrientes como proteínas, carbohidratos y ácidos grasos saturados e insaturados como fuentes de energía y bloques de construcción, y micronutrientes como cofactores y vitaminas13. Al igual que los mamíferos, los nematodos sintetizan moléculas de ácidos grasos tanto del ácido palmítico como del ácido esteárico (moléculas saturadas de 16 carbonos y 18 carbonos, respectivamente) que se desaturan secuencialmente y se alargan a una variedad de ácidos grasos monoinsaturados (MUFA) y ácidos grasos poliinsaturados (PUFA)14,15,16,17,18. Curiosamente, C. elegans es capaz de sintetizar de novo todos los ácidos grasos requeridos y enzimas centrales involucradas en la biosíntesis, desaturación y elongación de ácidos grasos, facilitando la síntesis de AGPI de cadena larga19. A diferencia de otras especies animales, C. elegans puede convertir ácidos grasos ω-6 de 18 carbonos y 20 carbonos en ácidos grasos ω-3 con sus propias enzimas desaturasas ω-3. Además, los gusanos poseen una Δ12 desaturasa que cataliza la formación de ácido linoleico (LA) a partir del ácido oleico (OA, 18:1)20,21. La mayoría de los animales o plantas carecen de desaturasas tanto Δ12 como ω-3 y, por lo tanto, dependen de la ingesta dietética de ω-6 y ω-3 para obtener sus AGPI, mientras que C. elegans no requiere ácidos grasos dietéticos22. Los mutantes aislados que carecen de enzimas desaturasas funcionales se han utilizado para estudiar las funciones de ácidos grasos específicos en distintos procesos biológicos, incluida la reproducción, el crecimiento, la longevidad y la neurotransmisión. El efecto de los ácidos grasos individuales sobre vías biológicas específicas puede ser abordado utilizando tanto un enfoque genético como la suplementación dietética16,17,23. Hasta la fecha, la investigación lipídica se ha centrado en la caracterización de genes implicados en la síntesis, degradación, almacenamiento y descomposición de lípidos en condiciones neurológicas y de desarrollo24. Sin embargo, los roles de los lípidos en la regulación de la longevidad apenas comienzan a revelarse.
Señalización lipídica en la regulación de la longevidad
Los lípidos juegan un papel crucial en la regulación de la longevidad mediante la activación de cascadas de señalización celular en distintos tejidos y tipos de células. Estudios recientes han destacado el papel activo de los lípidos en la modulación de la transcripción y la comunicación célula-célula a través de proteínas de unión a lípidos o el reconocimiento de receptores de membrana25. Además, la suplementación con lípidos en la dieta ofrece una excelente herramienta para diseccionar cómo el metabolismo de los lípidos influye en la vida útil de C. elegans. Se ha demostrado que distintos MUFA y PUFA promueven la longevidad mediante la activación de factores de transcripción26,27.
Los modelos de longevidad, incluida la señalización de insulina/IGF-1 y la ablación de células precursoras de la línea germinal, están asociados con la vía de biosíntesis de MUFA, y la suplementación con MUFA, que incluye ácido oleico, ácido palmitoleico y cis-vaccénico, es suficiente para extender la vida útil de C. elegans 26. Aunque el efecto de longevidad conferido por la administración de MUFA requiere más investigación, es probable que el mecanismo subyacente esté mediado por el factor de transcripción SKN-1/Nrf2, que es un activador clave de la respuesta al estrés oxidativo y la regulación de la longevidad28,29. Entre los MUFA, una clase particular de etanolamidas de acilo graso llamadas N-aciletanolaminas (NAE) desempeña un papel crucial en distintos mecanismos, incluyendo inflamación, alergias, aprendizaje, memoria y metabolismo energético30. En particular, la molécula lipídica conocida como oleoiletanolamida (OEA) ha sido identificada como un regulador positivo de la longevidad al promover la translocación de la proteína de unión a lípidos 8 (LBP-8) en el núcleo para activar los receptores de hormonas nucleares NHR-49 y NHR-807. La suplementación del análogo OEA KDS-5104 es suficiente para prolongar la vida útil e induce la expresión de genes implicados en las respuestas al estrés oxidativo y en la β-oxidación mitocondrial 7,8.
Al mismo tiempo, el papel de los PUFA también se ha relacionado con la regulación de la longevidad. La administración de AGPI ω-3 de ácidos grasos α-ácido linolénico (ALA) promueve la longevidad activando los factores de transcripción NHR-49/PPARα, SKN-1/NRF e induciendo la β-oxidación mitocondrial31. Curiosamente, los productos peroxidados de ALA, conocidos como oxilipinas, activan SKN-1/NRF, sugiriendo que tanto los AGPI como sus derivados oxidativos pueden conferir beneficios de longevidad23. La suplementación de ácido graso ω-6 ácido araquidónico (AA) y ácido dihomo-γ-linolénico (DGLA) extiende la vida útil a través de la activación de la autofagia, promoviendo el control de calidad de las proteínas y resultando en la degradación de agregados proteicos desperdiciados y tóxicos27,32. Más recientemente, una regulación de señalización celular no autónoma mediada por la proteína de unión a lípidos 3 (LBP-3) y DGLA ha demostrado ser crucial para promover la longevidad mediante el envío de señales periféricas a las neuronas, lo que sugiere un papel de largo alcance de las moléculas lipídicas en la comunicación intertisular a niveles sistémicos33. El presente estudio informa cada paso para realizar la suplementación lipídica con bacterias sembradas en placas o suspensión bacteriana en cultivo líquido. Estas metodologías se utilizan para evaluar la vida útil y el análisis transcripcional, empleando contenido corporal completo o tejidos disecados derivados de unos pocos gusanos. Las siguientes técnicas se pueden adaptar a una variedad de estudios nutricionales y ofrecen una herramienta válida para diseccionar cómo el metabolismo de los lípidos influye en la longevidad y el envejecimiento saludable.
Protocol
Representative Results
Discussion
La suplementación con lípidos se ha empleado en la investigación del envejecimiento para dilucidar el impacto directo de ciertas especies lipídicas en el envejecimiento saludable 6,7,23,26,27,31. Sin embargo, el procedimiento de suplementación con lípidos puede ser un desafío, y cualquier inconsistencia entre los exper…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a P. Svay por el apoyo de mantenimiento. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los NIH R01AG045183 (MCW), R01AT009050 (MCW), R01AG062257 (MCW), DP1DK113644 (MCW), March of Dimes Foundation (MCW), Welch Foundation (MCW), HHMI investigator (M.C.W.) y NIH T32 ES027801 predoctoral student fellow (M.S.). Algunas cepas fueron proporcionadas por el CGC, que está financiado por la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación de los NIH (P40 OD010440).
Materials
| 1.5 mL Pestle | Genesee Scientific | 93-165P15 | For worm grinding with Trizol |
| Agarose | Sigma | A9639-500G | |
| AmfiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix | GenDEPOT | R5600 | For reverse transcription from bulk worm samples |
| Applied Biosystems QuanStudio 3 Real-Time PCR | ThermoFisher | A28567 | For qRT-PCR |
| Benchmark Scientific StripSpin 12 Microcentrifuge | Benchmark Scientific | C1248 | For spin down PCR tubes |
| Branson 450 Digital Sonifier, w/ 1/8" tip | Branson Ultrasonic Corporation | 100-132-888R | |
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-500 | |
| Cholesterol | Sigma | C8503-25G | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418-100ML | |
| Eppendorf 5424 R centrifuge | Eppendorf | 22620444R | For RNA extraction |
| Eppendorf vapo protect mastercycler pro | Eppendorf | 950030010 | For reverse transcription |
| Ethanol, Absolute (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| Greiner Bio-One CELLSTAR, 12 W Plate | Neta Scientific | 665180 | 12-well plates for licuid feeding |
| Greiner Bio-One Petri Dish, Ps, 100 x 20 mm | Neta Scientific | 664161 | For bacterial LB plates and worm 10-cm NGM plates |
| Greiner Bio-One Petri Dish, Ps, 60 x 15 mm | Neta Scientific | 628161 | For worm6-cm NGM plates |
| Invitrogen nuclease-free water | ThermoFisher | AM9937 | |
| Isoproanol | Sigma | PX1835-2 | |
| Levamisole hydrochloride | VWR | SPCML1054 | |
| lipl-4Tg | MCW Lab | N/A | Transgenic C. elegans |
| lipl-4Tg;fat-3(wa22) | MCW Lab | N/A | Transgenic C. elegans |
| Luria Broth Base | ThermoFisher | 12795-084 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma | M2643-500G | |
| MicroAmp EnduraPlate Optical 96-Well Fast Clear Reaction Plate with Barcode | ThermoFisher | 4483354 | 96-well qPCR plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied BioSystem | 4311971 | For sealing the 96-well qPCR plate |
| Milli-Q Advantage A10 Water Purification System | Sigma | Z00Q0V0WW | Deionized water used to make all reagents, including buffer and cultural media, unless specified as nuclease-free water in the protocol |
| N2 | Caenorhabditis Genetics Center | N/A | C. elegans wild isolate |
| NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer | ThermoFisher | N/A | For measuring RNA concentration |
| OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | N/A | Bacteria used as C. elegans food |
| Potasium phosphate dibasic trihydrate (K2HPO4·3H2O) | Sigma | P5504-1KG | |
| Potasium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma | P0662-2.5KG | |
| Power SYBR Green cells-to-Ct kit | ThermoFisher | 4402953 | For reverse transcription and qPCR from a few worms or worm tissue |
| Power SYBR Green Master Mix | ThermoFisher | 4367659 | For qPCR from bulk worm samples |
| Pure Bright germicidal ultra bleach | KIK International LLC. | 59647210143 | 6% house bleach For worm egg preparation |
| Pyrex spot plate with nine depressions | Sigma | CLS722085-18EA | Watch glass for dissecting the worms |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | ThermoFisher | AM9780 | |
| Sodium cloride (NaCl) | Sigma | S7653-1KG | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | SX0590-3 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4·7H2O) | Sigma | S9390-1KG | |
| Thermo Sorvall Legend Mach 1.6R Centrifuge | Thermo | 7500-4337 | For bacteria collection |
| Thermo Sorvall ST 8 centrifuge | Thermo | 7500-7200 | For worm egg preparation |
| TRIzol Reagent | TheroFisher | 15596018 | RNA extraction reagent |
| Turbo DNA-free kit | ThermoFisher | AM1907 | For removing DNA contamination in RNA extractions |
| Vortexer 59 | Denville Scientific INV | S7030 | |
| VWR Disposable Pellet Mixers and Cordless Motor | VWR | 47747-370 | For worm grinding with Trizol |
| VWR Kinetic Energy 26 Joules Mini Centrifuge C1413 V-115 | VWR | N/A | For worm collection. Discontinued model, a similar one available at VWR with Cat# 76269-064 |
| Worm picker | WormStuff | 59-AWP |
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