הדמיה חיה של דינמיקת מיקרוטובולים בתאי גליובלסטומה הפולשים למוח דג הזברה
Summary
אנו מדווחים על טכניקה המאפשרת הדמיה חיה של דינמיקה של מיקרוטובולים בתאי גליובלסטומה (GBM) הפולשים לרקמת מוח של בעלי חוליות. צימוד ההזרקה האורתוטופית של תאי GBM המתויגים באופן פלואורסצנטי למוח שקוף של דגי זברה עם הדמיה תוך-חיונית ברזולוציה גבוהה מאפשר מדידה של דינמיקת השלד הציטוסקולרי במהלך פלישת סרטן באתרו .
Abstract
עם זמן הישרדות חציוני עגום באוכלוסיות אמיתיות – בין 6 ל -15 חודשים – גליובלסטומה (GBM) היא גידול המוח הממאיר ההרסני ביותר. כישלון הטיפול נובע בעיקר מהפולשנות של תאי GBM, מה שמדבר על הצורך בהבנה טובה יותר של תכונות תנועתיות GBM. כדי לחקור את המנגנון המולקולרי התומך בפלישת GBM, נדרשים מודלים פיזיולוגיים חדשים המאפשרים אפיון מעמיק של דינמיקה של חלבונים במהלך הפלישה. תצפיות אלה יסללו את הדרך לגילוי מטרות חדשות לחסימת חדירת גידולים ולשיפור תוצאות המטופלים. מאמר זה מדווח כיצד שתל אורתוטופי של תאי GBM במוח של דגי זברה מאפשר הדמיה חיה תוך-תאית תת-תאית. תוך התמקדות במיקרוטובולים (MTs), אנו מתארים הליך לתיוג MT בתאי GBM, מיקרו-הזרקה של תאי GBM במוח השקוף של 3 ימים לאחר ההפריה (dpf) זחלי דגי זברה, הדמיה תוך-חיונית של MTs בהפצת קסנוגרפטים, שינוי הדינמיקה של MT כדי להעריך את תפקידם במהלך פלישת GBM, וניתוח הנתונים שנרכשו.
Introduction
תנועתיות תאים היא תהליך סטריאוטיפי הדורש התבססות ציר קוטביות וסידור מחדש של ציטוסקטליים המייצרים כוח. פילמור אקטין והקשר שלו למיוזין מוכרים כתורמים העיקריים לכוחות בולטים ומתכווצים הנדרשים לתנועת תאים1. מיקרוטובולים נחשבים לשחקנים העיקריים בקיטוב התאים ובהתמדה כיוונית במהלך נדידה2. בשנים האחרונות הוכח גם כי MTs יוצרים ומייצבים בליטות כדי לתמוך בכוחות מכני-דחיסה במהלך פלישת תאים בתלת-ממד3. לאחרונה, MTs היו מעורבים ישירות במכניוטרנסדוקציה בהידבקויות מוקדיות והגירה מכאנו-סנסיטיבית4. חוסר היציבות הדינמי המאפיין את דינמיקת הקצה של MT-plus מורכב משלבים חוזרים ונשנים של פילמור (גדילה) ודה-פולימריזציה (התכווצות), הנשלטים על ידי שפע של חלבונים קושרי מיקרוטובולים ומפלי איתות תוך-תאיים, כגון אלה הנשלטים על ידי RHO-GTPases 5,6,7. תפקידה של רשת MT בנדידה ובפלישה של תאים הפך את חקר הדינמיקה של MT למרכיב מפתח להבנה טובה יותר של המנגנונים של ביות תאי מערכת החיסון, ריפוי פצעים ופלישה לסרטן.
היכולת של תאים סרטניים להימלט מליבת הגידול הראשונית, להתפשט ברקמות ולייצר גידולים משניים היא צעד קריטי במניעת הצלחה עולמית במלחמה בסרטן שהוכרזה לפני 50 שנה לפני 8,9. אחד המכשולים הגדולים ביותר היה הבנת האופן שבו תאים סרטניים פולשים באופן פעיל לרקמה. מנגנוני פלישה מרכזיים מסתמכים על אותם עקרונות כמו אלה השולטים בנדידה של תאים שאינם סרטניים10. עם זאת, מאפיינים ספציפיים של נדידת תאים סרטניים הופיעו11, מה שמעורר את הצורך באפיון טוב יותר של סוג זה של הגירה. באופן ספציפי, מכיוון שהמיקרו-סביבה של הגידול מופיעה כשחקן מפתח בהתקדמות הסרטן12, התבוננות וניתוח של פלישת תאים סרטניים בהקשר פיזיולוגי רלוונטי היא חיונית כדי לפענח את המנגנונים של הפצת תאים סרטניים.
MTs הם מרכזיים בהתקדמות הסרטן, כדי לקיים הן התפשטות והן פלישה. ניתוח מדויק של דינמיקת MT באתרו יכול לסייע בזיהוי חומרים משני MTA (MTA) בשני התהליכים. דינמיקת MT משתנה באופן דרסטי עם שינוי בסביבה. במבחנה, טיפול בחומרים מערערי יציבות MT כגון nocodazole מונע היווצרות בלט תאים כאשר תאים מוטבעים בג’לים בתלת-ממד, בעוד שיש לו השפעה מועטה על נדידת תאים דו-ממדית13,14. למרות שזה מאתגר מבחינה טכנית, ההתקדמות בהדמיה תוך-חיונית מאפשרת ניתוח in vivo של דינמיקת MT במהלך פלישה של תאים סרטניים. לדוגמה, תצפית של MTs בתאי פיברוסרקומה תת-עוריים בעכברים גילתה כי מקרופאגים הקשורים לגידול משפיעים על דינמיקת MT בתאי גידול15. עם זאת, מודלים אלה של עכברים כרוכים בהליכים כירורגיים נרחבים ונשארים לא מספקים עבור סוגי סרטן פחות נגישים, כגון גידול המוח הפולשני ביותר, GBM.
למרות זמן הישרדות עגום של15 חודשים ממוצע 16, מעט ידוע על אופן ההפצה של GBM בתוך הפרנכימה המוחית או על האלמנטים המולקולריים העיקריים המקיימים פלישה של תאי GBM לרקמת המוח. שיפור במודל xenograft אורתוטופי של עכבר (PDX) והקמת חלונות גולגולתיים הציעו סיכויים חדשים למחקרי פלישה לתאי GBM17,18. עם זאת, בשל איכות ההדמיה הלא אופטימלית, מודל זה התיר בעיקר הדמיה אורכית של קסנוגרפטים שטחיים ולא שימש בהצלחה לחקר הדמיה תת-תאית של חלבוני שלד ציטוסקטלי עד כה. יתר על כן, בעקבות צו המניעה “3Rs” להפחתת השימוש במכרסמים והחלפתם בבעלי חוליות נמוכים יותר, הוקמו מודלים חלופיים.
תוך ניצול החסינות הפרימיטיבית שנצפתה בזחלי דגי זברה (Danio rerio), פותחה הזרקה אורתוטופית של תאי GBM במוח הדג 19,20,21. הזרקה בקרבת החדרים במוח האמצעי המתפתח משחזרת את רוב הפתופיזיולוגיה האנושית של GBM21, ואותו דפוס מועדף של פלישת GBM כמו בבני אדם-כלי שיט משותף – נצפה22. הודות לשקיפות של זחלי הדגים, מודל זה מאפשר הדמיה של תאי GBM הפולשים למוח מהאזורים הפרי-חדריים שבהם רוב GBMs נחשבים להתעורר23.
מכיוון ש-MTs חיוניים לפלישה לתאי GBM במבחנה 24,25, יש צורך באפיון טוב יותר של דינמיקת MT וזיהוי של רגולטורים מרכזיים במהלך פלישה לתאים. עם זאת, עד כה, הנתונים שנוצרו עם המודל האורתוטופי של דג הזברה לא כללו ניתוח תת-תאי של דינמיקת MT במהלך תהליך הפלישה. מאמר זה מספק פרוטוקול לחקר הדינמיקה של MT in vivo ולקביעת תפקידו במהלך פלישה לסרטן המוח. בעקבות תיוג יציב של מיקרוטובולים, תאי GBM מוזרקים במיקרו-אינדסטריקט ב-3 dpf במוחם של זחלי דגי זברה ומצולמים בזמן אמת ברזולוציה מרחבית-טמפורלית גבוהה במהלך התקדמותם ברקמת המוח. הדמיה חיה של MTs פלואורסצנטיים מאפשרת ניתוח איכותי וכמותי של דינמיקת MT plus-end. יתר על כן, מודל זה מאפשר להעריך את ההשפעה של MTAs על הדינמיקה של MT ועל התכונות הפולשניות של תאי GBM בזמן אמת. פרוטוקול לא פולשני יחסית זה בשילוב עם מספר רב של זחלים המטופלים בו זמנית וקלות היישום של התרופה (במי הדגים) הופכים את המודל לנכס לבדיקות פרה-קליניות.
Protocol
Representative Results
Discussion
הדמיית קסנוגרפטים של גידולים ברזולוציה של תא בודד עשויה להפוך לכלי חיוני לשיפור הבנתנו את הביולוגיה של GBM. הדמיה חיה במודלים של PDX של עכברים הובילה לתגליות חשובות על האופן שבו GBM פולש באופן קולקטיבי לרקמת המוח18. עם זאת, עד כה, הרזולוציה המרחבית-טמפורלית אינה גבוהה מספיק כדי לחש?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים מאוד לד”ר פ. הרבומל (מכון פסטר, צרפת) ולמעבדתו, במיוחד ולרי בריולט, ואמה קולוצ’י-גויון על שסיפקו לנו את קווי דגי הזברה ואת תבנית הפלסטיק לצלחות מיקרו-הזרקה, ועל מומחיותם רבת הערך בהליכי ניסוי בדגי זברה. אנו מודים על ההדמיה הביולוגית הפוטונית של UtechS (C2RT, מכון פסטר, הנתמך על ידי סוכנות המחקר הלאומית הצרפתית France BioImaging, ו- ANR-10-INBS-04; השקעות לעתיד). עבודה זו נתמכה על ידי הליגה נגד סרטן (EL2017). LNCC), המרכז הלאומי דה לה רשרש סיינטיפיק, ומכון פסטר ועל ידי תרומות נדיבות של גברת מרגריט מישל ומר פורקט.
Materials
| Glioblastoma cell culture | |||
| Foetal calf serum | Eurobio | CVFSVF00-01 | Reagent |
| MEM NEAA | Gibco | 11140-050 | Reagent |
| Modified Eagle's medium | Eurobio | CM1MEM18-01 | Reagent |
| Penicillin–streptomycin | Gibco | 15140-122 | Reagent |
| U-87 MG | ECACC | 89081402-1VL | Cells |
| Lenitivirus production | |||
| BD FACSAria III | BD bioscience | Instrument | |
| BD FACSDiva software v8.0 | BD bioscience | Software | |
| HEK-293T | Merck | 12022001 | Cells |
| pMD2.G | Addgene | Plasmid #12259 | Reagent |
| psPAX2 | Addgene | Plasmid #12260 | Reagent |
| Ultracentrifuge Optima XPN-80 | Beckman Coulter | Instrument | |
| Cell passaging and staining | |||
| dPBS | Gibco | 14190-094 | Chemical |
| Hoechst 34580 | Sigma-Aldrich | 63493 | Chemical |
| Trypsin-EDTA (0,05%) | Gibco | 25300-054 | Reagent |
| Zebrafish husbandry | |||
| Fluorescence stereomicroscope LEICA M165FC | LEICA | https://www.leica-microsystems.com/fr/produits/stereomicroscopes-et-macroscopes/informations-detaillees/leica-m165-fc/ | Instrument |
| Methylene Blue hydrate | Sigma-Aldrich | M4159 | Chemical |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629-25G | Chemical |
| Transfer Pipettes fine tips | Samco Scientific | 232 | Equipment |
| Transfer Pipettes Large Bulb3mL | Samco Scientific | 225 | Equipment |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | Cat#: A5040 | Chemical |
| Volvic Source Water | DUTSCHER DOMINIQUE SAS | 999556 | Reagent |
| Xenotransplantation | |||
| 24-well plate | TPP | 92024 | Equipment |
| Borosilicate glass capillaries (1.0 ODx0.58IDx150L mm) | Harvard Apparatus | (#30-0017 GC100-15 | Equipment |
| CellTram oil vario microinjector | Eppendorf | 5176000.025 | Instrument |
| Microloading pipet tips (Microloader) 20µL | Eppendorf | 5242956003 | Equipment |
| Micromanipulator | NARISHIGE | https://products.narishige-group.com/group1/injection/english.html | Equipment |
| Mineral Oil | Sigma | M8410-100ml | Equipment |
| Stereomicroscope | Olympus | KL 2500 LCD | Instrument |
| Universal capillary holder | Eppendorf | 5176190002 | Equipment |
| Vertical Pipette puller | KOPF (Roucaire) | Model 720 | Instrument |
| Intravital Imaging | |||
| 3.5cm glass-bottom videoimaging dish | MatTek Life Sciences, MA, USA | P35G-1,5-14-C | Equipment |
| Acquisition software: NIS-Elements-AR version 5.21 | Nikon | Software | |
| Heat-Block | Techne | DRI-BLOCK DB-2D | Equipment |
| Microscope head Nikon Ti2E | Nikon | Instrument | |
| sCMOS camera Prime 95B | Photometrics | Instrument | |
| sCMOS camera Orca Flash 4 | Hammatsu | Instrument | |
| Ultrapure Low melting point agarose | Invitrogen | 16520-050 | Chemical |
| Yokagawa CSU-W1 spinning disk unit | Hammatsu | Instrument | |
| Drug Treatment | |||
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | Chemical |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404-2MG | Chemical |
| Image Analysis | |||
| Imaris 9.5.1 software | Oxford Instruments | Software | |
| ImarisFileConverter 9.5.1 | Oxford Instruments | Software |
References
- Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
- Etienne-Manneville, S. Microtubules in cell migration. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 471-499 (2013).
- Bouchet, B. P., Akhmanova, A. Microtubules in 3D cell motility. Journal of Cell Science. 130 (1), 39-50 (2017).
- Seetharaman, S., et al. Microtubules tune mechanosensitive cell responses. Nature Materials. 21 (3), 366-377 (2022).
- Etienne-Manneville, S. From signaling pathways to microtubule dynamics: the key players. Current Opinion in Cell Biology. 22 (1), 104-111 (2010).
- Garcin, C., Straube, A. Microtubules in cell migration. Essays in Biochemistry. 63 (5), 509-520 (2019).
- Dogterom, M., Koenderink, G. H. Actin-microtubule crosstalk in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (1), 38-54 (2019).
- Nature editorial. The ‘war on cancer’ isn’t yet won. Nature. 601 (297), (2022).
- Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Friedl, P., Alexander, S. Cancer invasion and the microenvironment: plasticity and reciprocity. Cell. 147 (5), 992-1009 (2011).
- Clark, A. G., Vignjevic, D. M. Modes of cancer cell invasion and the role of the microenvironment. Current Opinion in Cell Biology. 36, 13-22 (2015).
- Meyer, A. S., et al. 2D protrusion but not motility predicts growth factor-induced cancer cell migration in 3D collagen. Journal of Cell Biology. 197 (6), 721-729 (2012).
- Bouchet, B. P., et al. Mesenchymal cell invasion requires cooperative regulation of persistent microtubule growth by SLAIN2 and CLASP1. Developmental Cell. 39 (6), 708-723 (2016).
- Luthria, G., et al. In vivo microscopy reveals macrophage polarization locally promotes coherent microtubule dynamics in migrating cancer cells. Nature Commun. 11 (1), 3521 (2020).
- Wen, P. Y., Kesari, S. Malignant gliomas in adults. New England Journal of Medicine. 359 (5), 492-507 (2008).
- Ricard, C., Stanchi, F., Rougon, G., Debarbieux, F. An orthotopic glioblastoma mouse model maintaining brain parenchymal physical constraints and suitable for intravital two-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments. (86), e55108 (2014).
- Osswald, M., et al. Brain tumour cells interconnect to a functional and resistant network. Nature. 528 (7580), 93-98 (2015).
- Astell, K. R., Sieger, D. Investigating microglia-brain tumor cell interactions in vivo in the larval zebrafish brain. Methods in Cell Biology. , 593-626 (2017).
- Zeng, A., et al. Identify a blood-brain barrier penetrating drug-TNB using zebrafish orthotopic glioblastoma xenograft model. Scientific Reports. 7 (1), 14372 (2017).
- Welker, A. M., et al. Correction: Standardized orthotopic xenografts in zebrafish reveal glioma cell-line-specific characteristics and tumor cell heterogeneity. Disease Models & Mechanisms. 9 (9), 1063-1065 (2016).
- Umans, R. A., Ten Kate, M., Pollock, C., Sontheimer, H. Fishing for contact: modeling perivascular glioma invasion in the zebrafish brain. ACS Pharmacology & Translational Science. 4 (4), 1295-1305 (2021).
- Lee, J. H., et al. Human glioblastoma arises from subventricular zone cells with low-level driver mutations. Nature. 560 (7717), 243-247 (2018).
- Pagano, A., et al. Epothilone B inhibits migration of glioblastoma cells by inducing microtubule catastrophes and affecting EB1 accumulation at microtubule plus ends. Biochemical Pharmacology. 84 (4), 432-443 (2012).
- Berges, R., et al. The novel tubulin-binding checkpoint activator BAL101553 inhibits EB1-dependent migration and invasion and promotes differentiation of glioblastoma stem-like cells. Molecular Cancer Therapeutics. 15 (11), 2740-2749 (2016).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
- Volvic source water mineral composition. Volvic Available from: https://www.volvic.co.uk/volcanic-water/composition (2022)
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio). The University of Oregon Press, Eugene. , (2000).
- E3, M. . Recipe E3 medium (for zebrafish embryos. , (2011).
- Straube, A. How to measure microtubule dynamics. Methods in Molecular Biology. 777, 1-14 (2011).
- Honore, S., Braguer, D. Investigating microtubule dynamic instability using microtubule-targeting agents. Methods in Molecular Biology. 777, 245-260 (2011).
- Movsisyan, N., Pardo, L. A. Measurement of microtubule dynamics by spinning disk microscopy in monopolar mitotic spindles. Journal of Visualized Experiments. (153), e60478 (2019).
- Serikbaeva, A., Tvorogova, A., Kauanova, S., Vorobjev, I. A. Analysis of microtubule dynamics heterogeneity in cell culture. Methods in Molecular Biology. 1745, 181-204 (2018).
- Schnurr, M. E., Yin, Y., Scott, G. R. Temperature during embryonic development has persistent effects on metabolic enzymes in the muscle of zebrafish. Journal of Experimental Biology. 217 (8), 1370-1380 (2014).
- Yan, C., et al. Visualizing engrafted human cancer and therapy responses in immunodeficient zebrafish. Cell. 177 (7), 1903-1914 (2019).
- Li, G., Moore, J. K. Microtubule dynamics at low temperature: evidence that tubulin recycling limits assembly. Molecular Biology of the Cell. 31 (11), 1154-1166 (2020).
- Wu, J. S., et al. Plasticity of cancer cell invasion: Patterns and mechanisms. Translational Oncology. 14 (1), 100899 (2021).
- Hamilton, L., Astell, K. R., Velikova, G., Sieger, D. A zebrafish live imaging model reveals differential responses of microglia toward glioblastoma cells in vivo. Zebrafish. 13 (6), 523-534 (2016).
- Gillespie, S., Monje, M. An active role for neurons in glioma progression: making sense of Scherer’s structures. NeuroOncology. 20 (10), 1292-1299 (2018).
- Wolf, K. J., et al. A mode of cell adhesion and migration facilitated by CD44-dependent microtentacles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (21), 11432-11443 (2020).
- Zhou, Y. X., et al. Transcriptional upregulation of microtubule-associated protein 2 is involved in the protein kinase A-induced decrease in the invasiveness of glioma cells. Neuro-Oncology. 17 (12), 1578-1588 (2015).
- Monzo, P., et al. Mechanical confinement triggers glioma linear migration dependent on formin FHOD3. Molecular Biology of the Cell. 27 (8), 1246-1261 (2016).
- Vollmann-Zwerenz, A., Leidgens, V., Feliciello, G., Klein, C. A., Hau, P. Tumor cell invasion in glioblastoma. International Journal of Molecular Science. 21 (6), 1932 (2020).
- Feng, H., et al. EGFRvIII stimulates glioma growth and invasion through PKA-dependent serine phosphorylation of Dock180. Oncogene. 33 (19), 2504-2512 (2014).
- Liu, R., et al. Cdk5-mediated regulation of the PIKE-A-Akt pathway and glioblastoma cell invasion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (21), 7570-7575 (2008).
- Xiao, J., Glasgow, E., Agarwal, S. Zebrafish xenografts for drug discovery and personalized medicine. Trends in Cancer. 6 (7), 569-579 (2020).
- Baxendale, S., van Eeden, F., Wilkinson, R. The power of zebrafish in personalised medicine. Personalised Medicine: Lessons from Neurodegeneration to Cancer. 1007, 179-197 (2017).
- Cramer, S. W., et al. Through the looking glass: A review of cranial window technology for optical access to the brain. Journal of Neuroscience Methods. 354, 109100 (2021).
- Stanchi, F., Matsumoto, K., Gerhardt, H. Imaging glioma progression by intravital microscopy. Methods in Molecular Biology. 1862, 227-243 (2019).
