Riportiamo una tecnica che consente l'imaging dal vivo della dinamica dei microtubuli nelle cellule di glioblastoma (GBM) che invadono un tessuto cerebrale dei vertebrati. L'accoppiamento dell'iniezione ortotopica di cellule GBM marcate con fluorescenza in un cervello di zebrafish trasparente con imaging intravitale ad alta risoluzione consente la misurazione della dinamica del citoscheletro durante l'invasione del cancro in situ .
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Articolo metodologico
Imaging dal vivo della dinamica dei microtubuli nelle cellule di glioblastoma che invadono il cervello del pesce zebra
In questo articolo
Sommario
Abstract
Con un triste tempo di sopravvivenza mediano nelle popolazioni reali - tra 6 e 15 mesi - il glioblastoma (GBM) è il tumore cerebrale maligno più devastante. Il fallimento del trattamento è dovuto principalmente all'invasività delle cellule GBM, che parla della necessità di una migliore comprensione delle proprietà mobili GBM. Per studiare il meccanismo molecolare che supporta l'invasione del GBM, sono necessari nuovi modelli fisiologici che consentano una caratterizzazione approfondita della dinamica delle proteine durante l'invasione. Queste osservazioni aprirebbero la strada alla scoperta di nuovi bersagli per bloccare l'infiltrazione tumorale e migliorare i risultati dei pazienti. Questo articolo riporta come uno xenotrapianto ortotopico di cellule GBM nel cervello del pesce zebra consenta l'imaging dal vivo intravitale subcellulare. Concentrandoci sui microtubuli (MT), descriviamo una procedura per l'etichettatura MT nelle cellule GBM, la microiniezione di cellule GBM nel cervello trasparente delle larve di zebrafish 3 giorni dopo la fecondazione (DPF), l'imaging intravitale delle MT negli xenotrapianti disseminanti, l'alterazione della dinamica della MT per valutare il loro ruolo durante l'invasione GBM e l'analisi dei dati acquisiti.
Introduzione
La motilità cellulare è un processo stereotipato che richiede la creazione dell'asse di polarità e riarrangiamenti citoscheletrici generatori di forza. La polimerizzazione dell'actina e la sua associazione con la miosina sono riconosciute come i principali contributori alle forze protrusive e contrattili richieste per il movimento cellulare1. I microtubuli sono considerati i principali attori della polarizzazione cellulare e della persistenza direzionale durante la migrazione2. Negli ultimi anni, le MT hanno anche dimostrato di creare e stabilizzare protrusioni per supportare le forze di meccanocompressione durante l'inv....
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Protocollo
Gli esperimenti sugli animali sono stati condotti secondo le linee guida dell'Unione europea per la manipolazione di animali da laboratorio. Tutti i protocolli sono stati approvati dal Comitato Etico per la Sperimentazione Animale dell'Institut Pasteur - CEEA 89 e dal Ministero della Ricerca e dell'Istruzione francese (permesso #01265.03). Durante le iniezioni o le sessioni di imaging dal vivo, gli animali sono stati anestetizzati con Tricaine.At la fine delle procedure sperimentali, sono stati eutanizzati da overdose di anestetico. Vedere la tabella dei materiali per i dettagli relativi ai materiali, alle attrezzature e al software utilizzati in ques....
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Risultati
Per analizzare il ruolo svolto dalle MT durante l'invasione GBM in vivo, descriviamo qui i principali passi per eseguire la marcatura MT stabile nelle cellule GBM mediante infezione lentivirale, xenotrapianti ortotopici di cellule GBM in larve di zebrafish 3 dpf, imaging intravitale ad alta risoluzione della dinamica MT, trattamento MTA e suoi effetti sull'invasione GBM e analisi delle immagini della dinamica MT e invasione in vivo (Figura 1). La dinamica .......
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Discussione
È probabile che l'imaging di xenotrapianti tumorali a risoluzione singola cellulare diventi uno strumento indispensabile per migliorare la nostra comprensione della biologia GBM. L'imaging dal vivo nei modelli PDX murini ha portato a preziose scoperte su come GBM invade collettivamente il tessuto cerebrale18. Tuttavia, ad oggi, la risoluzione spaziotemporale non è abbastanza alta da rivelare la dinamica delle proteine che controllano l'invasione GBM. Abbiamo ragionato che accoppiando l'attecchimen.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Ringraziamenti
Siamo estremamente grati al Dr. P. Herbomel (Institut Pasteur, Francia) e al suo laboratorio, in particolare Valérie Briolat, ed Emma Colucci-Guyon per averci fornito le linee zebrafish e lo stampo in plastica per le piastre di microiniezione, e per la loro preziosa esperienza sulle procedure sperimentali del pesce zebra. Riconosciamo con gratitudine UtechS Photonic BioImaging (C2RT, Institut Pasteur, supportato dall'Agenzia nazionale francese per la ricerca France BioImaging, e ANR-10-INBS-04; Investimenti per il futuro). Questo lavoro è stato sostenuto dalla Ligue contre le cancer (EL2017. LNCC), il Centre National de la Recherche Scientifique, e l'Institut Pasteur ....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Coltura cellulare di glioblastoma | |||
| Siero di vitello fetale | Eurobio | CVFSVF00-01 | Reagente |
| MEM NEAA | Gibco | 11140-050 | Reagente |
| Medium di Eagle modificato | Eurobio | CM1MEM18-01 | Reagente |
| Penicillina... streptomicina | Gibco | 15140-122 | Reagente |
| U-87 MG | ECACC | 89081402-1VL | |
| CelluleProduzione di Lenitivirus | |||
| BD FACSAria III | BD bioscienze | Strumento | |
| BD FACSDiva software v8.0 | BD bioscienze | Software | |
| HEK-293T | Merck | 12022001 | Cells |
| pMD2.G | Addgene | Plasmid #12259 | Reagente |
| psPAX2 | Addgene | Plasmid #12260 | Reagente |
| Ultracentrifuga Optima XPN-80 | Beckman Coulter | Instrument | |
| Cell Passging and coloring | |||
| dPBS | Gibco | 14190-094 | Chimico |
| Hoechst 34580 | Sigma-Aldrich | 63493 | |
| Tripsina-EDTA chimica (0,05%) | Gibco | 25300-054 | Reagent |
| Zebrafish allevamento | |||
| Stereomicroscopio a fluorescenza LEICA M165FC | LEICA | https://www.leica-microsystems.com/fr/produits/stereomicroscopes-et-macroscopes/informations-detaillees/leica-m165-fc/ | Strumento |
| Idrato di metilene blu | Sigma-Aldrich | M4159 | Chimico |
| N-Feniltiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629-25G | Trasferimento chimico |
| Pipette punte fini | Samco | Scientific 232 | Trasferimento di attrezzature |
| Pipette Bulbo grande3mL | Samco Scientific | 225 | Attrezzatura |
| Tricaina (Etile 3-amminobenzoato metanosulfonato) | Sigma-Aldrich | Cat#: A5040 | Acqua di |
| sorgente volvica | DUTSCHER DOMINIQUE SAS | Reagent | |
| Xenotransplantation | |||
| piastra a 24 pozzetti | TPP | 92024 | Attrezzatura |
| Capillari in vetro borosilicato (1,0 ODx0,58IDx150L mm) | Apparato Harvard | (#30-0017 GC100-15 | Attrezzatura |
| CellTram olio vario microiniettore | Eppendorf | 5176000.025 | Strumento |
| Microcaricamento puntali per pipette (Microloader) 20µ L | Eppendorf | 5242956003 | |
| Attrezzatura Micromanipolatore | NARISHIGE | https://products.narishige-group.com/group1/injection/english.html | Attrezzatura |
| Olio Minerale | Sigma | M8410-100ml | |
| Attrezzatura Stereomicroscopio | Olympus | KL 2500 LCD | Strumento |
| capillare universale | Eppendorf | 5176190002 | Attrezzatura |
| Estrattore verticale per pipette | KOPF (Roucaire) | Modello 720 | Instrument |
| Intravital Imaging | |||
| 3,5 cm piatto di videoimaging con fondo in vetro | MatTek Life Sciences, MA, USA | P35G-1,5-14-C | Software di acquisizione dell'attrezzatura |
| : NIS-Elements-AR versione 5.21 | Nikon | Software | |
| Heat-Block | Techne | DRI-BLOCK DB-2D | Attrezzatura |
| Testa del microscopio Nikon Ti2E | Nikon | Instrument | |
| sCMOS camera Prime 95B | Photometrics | Instrument | |
| sCMOS camera Orca Flash 4 | Hammatsu | ||
| Instrument Ultrapure Basso punto di fusione agarosio | Invitrogen | 16520-050 | Chemical |
| Yokagawa CSU-W1 spinning disk unità | Hammatsu | Instrument | |
| Drug Treatment | |||
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
| Nocodazolo | Sigma-Aldrich | M1404-2MG | Chemical |
| Image Analysis | |||
| Imaris 9.5.1 software | Oxford Strumenti | Software | |
| ImarisFileConverter 9.5.1 | Oxford Instruments | Software |
Riferimenti
- Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
- Etienne-Manneville, S. Microtubules in cell migration. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 471-499 (2013).
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Ristampe e permessi
