हम एक ऐसी तकनीक की रिपोर्ट करते हैं जो एक कशेरुक मस्तिष्क ऊतक पर हमला करने वाले ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम) कोशिकाओं में सूक्ष्मनलिका गतिशीलता की लाइव इमेजिंग की अनुमति देती है। फ्लोरोसेंटली टैग किए गए जीबीएम कोशिकाओं के ऑर्थोटोपिक इंजेक्शन को उच्च-रिज़ॉल्यूशन इंट्रावाइटल इमेजिंग के साथ एक पारदर्शी ज़ेब्राफिश मस्तिष्क में जोड़ना सीटू कैंसर आक्रमण के दौरान साइटोस्केलेटन गतिशीलता के माप की अनुमति देता है।
वास्तविक आबादी में एक निराशाजनक औसत जीवित रहने के समय के साथ- 6 से 15 महीने के बीच-ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम) सबसे विनाशकारी घातक मस्तिष्क ट्यूमर है। उपचार की विफलता मुख्य रूप से जीबीएम कोशिकाओं की आक्रामकता के कारण होती है, जो जीबीएम मोटाइल गुणों की बेहतर समझ की आवश्यकता के लिए बोलती है। जीबीएम आक्रमण का समर्थन करने वाले आणविक तंत्र की जांच करने के लिए, आक्रमण के दौरान प्रोटीन गतिशीलता के गहन लक्षण वर्णन को सक्षम करने वाले नए शारीरिक मॉडल की आवश्यकता होती है। ये अवलोकन ट्यूमर घुसपैठ को रोकने और रोगी के परिणामों में सुधार करने के लिए नए लक्ष्यों की खोज का मार्ग प्रशस्त करेंगे। यह पेपर रिपोर्ट करता है कि कैसे ज़ेब्राफिश मस्तिष्क में जीबीएम कोशिकाओं का एक ऑर्थोटोपिक जेनोग्राफ्ट उपकोशिकीय इंट्रावाइटल लाइव इमेजिंग की अनुमति देता है। सूक्ष्मनलिकाएं (एमटी) पर ध्यान केंद्रित करते हुए, हम जीबीएम कोशिकाओं में एमटी लेबलिंग के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन करते हैं, निषेचन (डीपीएफ) जेब्राफिश लार्वा के पारदर्शी मस्तिष्क में जीबीएम कोशिकाओं को माइक्रोइंजेक्शन करना, जेनोग्राफ्ट्स के प्रसार में एमटी की इंट्रावाइटल इमेजिंग, जीबीएम आक्रमण के दौरान उनकी भूमिका का आकलन करने के लिए एमटी गतिशीलता को बदलना और अधिग्रहित डेटा का विश्लेषण करना।
सेल गतिशीलता एक रूढ़िबद्ध प्रक्रिया है जिसमें ध्रुवीयता अक्ष स्थापना और बल-उत्पन्न साइटोस्केलेटल पुनर्व्यवस्था की आवश्यकता होती है। एक्टिन पोलीमराइजेशन और मायोसिन के साथ इसके सहयोग कोसेल आंदोलन के लिए आवश्यक प्रोट्रूसिव और सिकुड़ा हुआ बलों के मुख्य योगदानकर्ताओं के रूप में मान्यता प्राप्त है। माइग्रेशन 2 के दौरान कोशिका ध्रुवीकरण और दिशात्मक दृढ़ता में सूक्ष्मनलिकाएं मुख्य अभिनेता माना जाताहै। हाल के वर्षों में, एमटी को 3 डी3 में सेल आक्रमण के दौरान मेकेनोकंप्रेसिव बलों का समर्थन करने के लिए प्रोट्रूशियंस बनाने और स्थिर करने के लिए भी दिखाया गया है। हाल ही में, एमटी सीधे फोकल आसंजन और मेकेनोसेंसिटिव माइग्रेशन4 पर मेकेनोट्रांसडक्शन में शामिल रहे हैं। एमटी-प्लस एंड डायनामिक्स की विशेषता वाली गतिशील अस्थिरता पोलीमराइजेशन (विकास) और डिपोलीमराइजेशन (संकोचन) के दोहराए गए चरणों से बनी होती है, जो सूक्ष्मनलिका-बाध्यकारी प्रोटीन और इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग कैस्केड के ढेरों द्वारा नियंत्रित होते हैं, जैसे कि आरएचओ-जीटीपेस 5,6,7 द्वारा शासित। सेल माइग्रेशन और आक्रमण में एमटी नेटवर्क की भूमिका ने एमटी गतिशीलता की जांच को प्रतिरक्षा कोशिका होमिंग, घाव भरने और कैंसर आक्रमण के तंत्र को बेहतर ढंग से समझने के लिए एक महत्वपूर्ण तत्व बना दिया है।
प्राथमिक ट्यूमर कोर से बचने, ऊतकों में फैलने और माध्यमिक ट्यूमर उत्पन्न करने के लिए कैंसर कोशिकाओं की क्षमता 50साल पहले घोषित कैंसर के खिलाफ युद्ध में वैश्विक सफलता को रोकने में एक महत्वपूर्ण कदम है। सबसे बड़ी बाधाओं में से एक यह समझना है कि कैंसर कोशिकाएं ऊतक पर सक्रिय रूप से कैसे आक्रमण करती हैं। प्रमुख आक्रमण तंत्र गैर-ट्यूमर सेल माइग्रेशन10 को नियंत्रित करने वाले सिद्धांतों के समान सिद्धांतों पर भरोसा करते हैं। हालांकि, कैंसर सेल माइग्रेशन विशिष्टताएंउभरी हैं, जिससे इस प्रकार के प्रवास के बेहतर लक्षण वर्णन की आवश्यकता है। विशेष रूप से, क्योंकि ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट कैंसर की प्रगति12 में एक प्रमुख खिलाड़ी के रूप में दिखाई देता है, कैंसर सेल प्रसार के तंत्र को उजागर करने के लिए एक प्रासंगिक शारीरिक संदर्भ में कैंसर सेल आक्रमण का अवलोकन और विश्लेषण करना आवश्यक है।
एमटी कैंसर की प्रगति के लिए केंद्रीय हैं, प्रसार और आक्रमण दोनों को बनाए रखने के लिए। सीटू में एमटी गतिशीलता का सटीक विश्लेषण दोनों प्रक्रियाओं में एमटी-चेंजिंग एजेंटों (एमटीए) की पहचान करने में मदद कर सकता है। पर्यावरण में बदलाव पर एमटी गतिशीलता काफी भिन्न होती है। इन विट्रो में, नोकोडाज़ोल जैसे एमटी-अस्थिर एजेंटों के साथ उपचार सेल प्रोट्रूशन गठन को रोकता है जब कोशिकाएं 3 डी में जैल में एम्बेडेड होती हैं, जबकि 2 डी सेल माइग्रेशन13,14 पर इसका बहुत कम प्रभाव पड़ता है। हालांकि तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण, इंट्रावाइटल इमेजिंग में प्रगति कैंसर सेल आक्रमण के दौरान एमटी गतिशीलता के विवो विश्लेषण में अनुमति देती है। उदाहरण के लिए, चूहों में चमड़े के नीचे जेनोग्राफ्ड फाइब्रोसारकोमा कोशिकाओं में एमटी के अवलोकन से पता चला कि ट्यूमर से जुड़े मैक्रोफेजट्यूमर कोशिकाओं में एमटी गतिशीलता को प्रभावित करते हैं। हालांकि, इन माउस मॉडल में व्यापक शल्य चिकित्सा प्रक्रियाएं शामिल हैं और कम सुलभ कैंसर के लिए असंतोषजनक रहते हैं, जैसे कि अत्यधिक आक्रामक मस्तिष्क ट्यूमर, जीबीएम।
निराशाजनक 15 महीने के औसत जीवित रहने के समय16 के बावजूद, मस्तिष्क पैरेन्काइमा के भीतर जीबीएम के प्रसार के तरीके या मस्तिष्क के ऊतकों में जीबीएम सेल आक्रमण को बनाए रखने वाले प्रमुख आणविक तत्वों के बारे में बहुत कम जानकारी है। माउस ऑर्थोटोपिक जेनोग्राफ्ट (पीडीएक्स) मॉडल में सुधार और कपाल खिड़कियों की स्थापना ने जीबीएम सेल आक्रमण अध्ययन17,18 के लिए नई संभावनाओं की पेशकश की। हालांकि, सबऑप्टिमल इमेजिंग गुणवत्ता के कारण, इस मॉडल ने ज्यादातर सतही जेनोग्राफ्ट्स की अनुदैर्ध्य इमेजिंग की अनुमति दी है और अब तक साइटोस्केलेटन प्रोटीन के उपकोशिकीय इमेजिंग का अध्ययन करने के लिए सफलतापूर्वक उपयोग नहीं किया गया है। इसके अलावा, कृन्तकों के उपयोग को कम करने और उन्हें निचले कशेरुकियों के साथ बदलने के लिए “3आर” निषेधाज्ञा के मद्देनजर, वैकल्पिक मॉडल स्थापित किए गए हैं।
ज़ेबराफिश (डेनियो रेरियो) लार्वा में देखी गई आदिम प्रतिरक्षा का लाभ उठाते हुए, मछली के मस्तिष्क में जीबीएम कोशिकाओं का ऑर्थोटोपिक इंजेक्शन 19,20,21 विकसित किया गया था। विकासशील मिडब्रेन में वेंट्रिकल्स के आसपास के क्षेत्र में इंजेक्शन मानव जीबीएम पैथोफिज़ियोलॉजी21 के अधिकांश हिस्से को पुन: उत्पन्न करता है, और जीबीएम आक्रमण का वही पसंदीदा पैटर्न देखा जाता है जैसा कि मनुष्यों-पोत सह-विकल्प में देखाजाता है। मछली के लार्वा की पारदर्शिता के लिए धन्यवाद, यह मॉडल पेरी-वेंट्रिकुलर क्षेत्रों से मस्तिष्क पर हमला करने वाली जीबीएम कोशिकाओं के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है जहां अधिकांश जीबीएम को उत्पन्न माना जाताहै।
चूंकि एमटी विट्रो24,25 में जीबीएम सेल आक्रमण के लिए आवश्यक हैं, एमटी गतिशीलता का बेहतर लक्षण वर्णन और सेल आक्रमण के दौरान प्रमुख नियामकों की पहचान की आवश्यकता है। हालांकि, आज तक, ज़ेबराफिश ऑर्थोटोपिक मॉडल के साथ उत्पन्न डेटा में आक्रमण प्रक्रिया के दौरान एमटी गतिशीलता का उपकोशिकीय विश्लेषण शामिल नहीं है। यह पेपर विवो में एमटी गतिशीलता का अध्ययन करने और मस्तिष्क कैंसर आक्रमण के दौरान इसकी भूमिका निर्धारित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करता है। स्थिर सूक्ष्मनलिका लेबलिंग के बाद, जीबीएम कोशिकाओं को ज़ेब्राफिश लार्वा के दिमाग में 3 डीपीएफ पर सूक्ष्म इंजेक्शन दिया जाता है और मस्तिष्क के ऊतकों में उनकी प्रगति के दौरान वास्तविक समय में उच्च स्थानिक-अस्थायी संकल्प पर चित्रित किया जाता है। फ्लोरोसेंट एमटी की लाइव इमेजिंग एमटी प्लस-एंड गतिशीलता के गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमति देती है। इसके अलावा, यह मॉडल एमटी गतिशीलता पर और वास्तविक समय में जीबीएम कोशिकाओं के आक्रामक गुणों पर एमटीए के प्रभाव का आकलन करना संभव बनाता है। यह अपेक्षाकृत गैर-इनवेसिव प्रोटोकॉल एक समय में बड़ी संख्या में लार्वा को संभालने और दवा के आवेदन में आसानी (मछली के पानी में) के साथ संयुक्त है, जो मॉडल को प्रीक्लिनिकल परीक्षण के लिए एक संपत्ति बनाता है।
एकल-कोशिका संकल्प पर इमेजिंग ट्यूमर जेनोग्राफ्ट्स जीबीएम जीव विज्ञान की हमारी समझ में सुधार करने के लिए एक अनिवार्य उपकरण बनने की संभावना है। माउस पीडीएक्स मॉडल में लाइव इमेजिंग ने मूल्यवान खोजों को…
The authors have nothing to disclose.
हर्बोमेल (इंस्टीट्यूट पाश्चर, फ्रांस) और उनकी प्रयोगशाला, विशेष रूप से वैलेरी ब्रिओलैट और एम्मा कोलुची-गुयोन के लिए बेहद आभारी हैं कि उन्होंने हमें जेब्राफिश लाइनें और माइक्रोइंजेक्शन प्लेटों के लिए प्लास्टिक मोल्ड प्रदान किया, और ज़ेब्राफिश प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं पर उनकी मूल्यवान विशेषज्ञता के लिए। हम फ्रेंच नेशनल रिसर्च एजेंसी फ्रांस बायोइमेजिंग और एएनआर -10-आईएनबीएस -04 द्वारा समर्थित यूटीसीएस फोटोनिक बायोइमेजिंग (सी 2आरटी, इंस्टीट्यूट पाश्चर) को कृतज्ञतापूर्वक स्वीकार करते हैं; भविष्य के लिए निवेश)। इस काम को लिग्यू कॉन्ट्रे ले कैंसर (ईएल 2017) द्वारा समर्थित किया गया था। एलएनसीसी, सेंटर नेशनल डे ला रेचरचे साइंटिफिक, और इंस्टीट्यूट पाश्चर और श्रीमती मार्गुराइट मिशेल और श्री पोरक्वेट के उदार दान द्वारा।
Glioblastoma cell culture | |||
Foetal calf serum | Eurobio | CVFSVF00-01 | Reagent |
MEM NEAA | Gibco | 11140-050 | Reagent |
Modified Eagle's medium | Eurobio | CM1MEM18-01 | Reagent |
Penicillin–streptomycin | Gibco | 15140-122 | Reagent |
U-87 MG | ECACC | 89081402-1VL | Cells |
Lenitivirus production | |||
BD FACSAria III | BD bioscience | Instrument | |
BD FACSDiva software v8.0 | BD bioscience | Software | |
HEK-293T | Merck | 12022001 | Cells |
pMD2.G | Addgene | Plasmid #12259 | Reagent |
psPAX2 | Addgene | Plasmid #12260 | Reagent |
Ultracentrifuge Optima XPN-80 | Beckman Coulter | Instrument | |
Cell passaging and staining | |||
dPBS | Gibco | 14190-094 | Chemical |
Hoechst 34580 | Sigma-Aldrich | 63493 | Chemical |
Trypsin-EDTA (0,05%) | Gibco | 25300-054 | Reagent |
Zebrafish husbandry | |||
Fluorescence stereomicroscope LEICA M165FC | LEICA | https://www.leica-microsystems.com/fr/produits/stereomicroscopes-et-macroscopes/informations-detaillees/leica-m165-fc/ | Instrument |
Methylene Blue hydrate | Sigma-Aldrich | M4159 | Chemical |
N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629-25G | Chemical |
Transfer Pipettes fine tips | Samco Scientific | 232 | Equipment |
Transfer Pipettes Large Bulb3mL | Samco Scientific | 225 | Equipment |
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | Cat#: A5040 | Chemical |
Volvic Source Water | DUTSCHER DOMINIQUE SAS | 999556 | Reagent |
Xenotransplantation | |||
24-well plate | TPP | 92024 | Equipment |
Borosilicate glass capillaries (1.0 ODx0.58IDx150L mm) | Harvard Apparatus | (#30-0017 GC100-15 | Equipment |
CellTram oil vario microinjector | Eppendorf | 5176000.025 | Instrument |
Microloading pipet tips (Microloader) 20µL | Eppendorf | 5242956003 | Equipment |
Micromanipulator | NARISHIGE | https://products.narishige-group.com/group1/injection/english.html | Equipment |
Mineral Oil | Sigma | M8410-100ml | Equipment |
Stereomicroscope | Olympus | KL 2500 LCD | Instrument |
Universal capillary holder | Eppendorf | 5176190002 | Equipment |
Vertical Pipette puller | KOPF (Roucaire) | Model 720 | Instrument |
Intravital Imaging | |||
3.5cm glass-bottom videoimaging dish | MatTek Life Sciences, MA, USA | P35G-1,5-14-C | Equipment |
Acquisition software: NIS-Elements-AR version 5.21 | Nikon | Software | |
Heat-Block | Techne | DRI-BLOCK DB-2D | Equipment |
Microscope head Nikon Ti2E | Nikon | Instrument | |
sCMOS camera Prime 95B | Photometrics | Instrument | |
sCMOS camera Orca Flash 4 | Hammatsu | Instrument | |
Ultrapure Low melting point agarose | Invitrogen | 16520-050 | Chemical |
Yokagawa CSU-W1 spinning disk unit | Hammatsu | Instrument | |
Drug Treatment | |||
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | Chemical |
Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404-2MG | Chemical |
Image Analysis | |||
Imaris 9.5.1 software | Oxford Instruments | Software | |
ImarisFileConverter 9.5.1 | Oxford Instruments | Software |