Omurgalı beyin dokusunu invaze eden glioblastoma (GBM) hücrelerinde mikrotübül dinamiklerinin canlı görüntülenmesine izin veren bir teknik sunuyoruz. Floresan etiketli GBM hücrelerinin ortotopik enjeksiyonunun, yüksek çözünürlüklü intravital görüntüleme ile şeffaf bir zebra balığı beynine bağlanması, in situ kanser invazyonu sırasında sitoiskelet dinamiklerinin ölçülmesini sağlar.
Gerçek popülasyonlarda kasvetli bir medyan sağkalım süresi ile – 6 ila 15 ay arasında – glioblastom (GBM) en yıkıcı malign beyin tümörüdür. Tedavi başarısızlığı esas olarak GBM hücrelerinin invazivliğinden kaynaklanmaktadır, bu da GBM hareketli özelliklerinin daha iyi anlaşılması ihtiyacını ifade etmektedir. GBM invazyonunu destekleyen moleküler mekanizmayı araştırmak için, invazyon sırasında protein dinamiklerinin derinlemesine karakterizasyonunu sağlayan yeni fizyolojik modellere ihtiyaç vardır. Bu gözlemler, tümör infiltrasyonunu bloke etmek ve hasta sonuçlarını iyileştirmek için yeni hedeflerin keşfine yol açacaktır. Bu makale, zebra balığı beynindeki GBM hücrelerinin ortotopik ksenograftının hücre altı intravital canlı görüntülemeye nasıl izin verdiğini bildirmektedir. Mikrotübüllere (MT’ler) odaklanarak, GBM hücrelerinde MT etiketleme, döllenme sonrası 3 gün (dpf) zebra balığı larvalarının şeffaf beyninde GBM hücrelerinin mikroenjekte edilmesi, yayılan ksenogreftlerde MT’lerin intravital görüntülenmesi, GBM invazyonu sırasında rollerini değerlendirmek için MT dinamiklerini değiştirme ve elde edilen verileri analiz etme prosedürünü açıklıyoruz.
Hücre hareketliliği, polarite ekseni oluşturulmasını ve kuvvet üreten sitoiskelet yeniden düzenlemelerini gerektiren kalıplaşmış bir süreçtir. Aktin polimerizasyonu ve miyozin ile ilişkisi, hücre hareketi için gerekli olan çıkıntılı ve kontraktil kuvvetlere ana katkıda bulunanlar olarak kabul edilmektedir1. Mikrotübüller, hücre polarizasyonunda ve göç sırasında yönlü kalıcılıkta ana aktörler olarak kabul edilir2. Son yıllarda, MT’lerin 3D3’te hücre invazyonu sırasında mekanokompresif kuvvetleri desteklemek için çıkıntılar oluşturduğu ve stabilize ettiği gösterilmiştir. Daha yakın zamanlarda, MT’ler fokal adezyonlar ve mekanosensitif migrasyonda mekanotransdüksiyona doğrudan dahil olmuştur4. MT-plus uç dinamiklerini karakterize eden dinamik kararsızlık, RHO-GTPazlar 5,6,7 tarafından yönetilenler gibi çok sayıda mikrotübül bağlayıcı protein ve hücre içi sinyal kaskadları tarafından kontrol edilen tekrarlanan polimerizasyon (büyüme) ve depolimerizasyon (büzülme) aşamalarından oluşur. MT ağının hücre göçü ve invazyonundaki rolü, MT dinamiklerinin araştırılmasını, bağışıklık hücresi homing, yara iyileşmesi ve kanser invazyonu mekanizmalarını daha iyi anlamak için kilit bir unsur haline getirmiştir.
Kanser hücrelerinin birincil tümör çekirdeğinden kaçma, dokulara yayılma ve ikincil tümörler üretme yeteneği, 50 yıl önceilan edilen kansere karşı savaşta küresel başarıyı önlemede kritik bir adımdır 8,9. En büyük engellerden biri, kanser hücrelerinin dokuyu aktif olarak nasıl istila ettiğini anlamaktır. Anahtar invazyon mekanizmaları, tümörlü olmayan hücre göçünü yönetenlerle aynı prensiplere dayanır10. Bununla birlikte, kanser hücresi göçü özgüllükleriortaya çıkmıştır 11, bu da bu göç türünün daha iyi karakterize edilmesine duyulan ihtiyacı tetiklemektedir. Spesifik olarak, tümör mikroçevresi kanser progresyonunda kilit bir oyuncu olarak göründüğü için12, kanser hücresi invazyonunu ilgili fizyolojik bağlamda gözlemlemek ve analiz etmek, kanser hücresi yayılma mekanizmalarını çözmek için gereklidir.
MT’ler, hem proliferasyon hem de istilayı sürdürmek için kanser progresyonunun merkezindedir. MT dinamiklerinin yerinde hassas analizi, her iki proseste de MT değiştirici ajanların (MTA) tanımlanmasına yardımcı olabilir. MT dinamikleri, ortamdaki bir değişikliğe bağlı olarak büyük ölçüde değişir. In vitro, nokodazol gibi MT-istikrarsızlaştırıcı ajanlarla tedavi, hücreler 3D jellere gömüldüğünde hücre çıkıntısı oluşumunu önlerken, 2D hücre göçü13,14 üzerinde çok az etkisi vardır. Teknik olarak zor olmasına rağmen, intravital görüntülemedeki ilerlemeler, kanser hücresi invazyonu sırasında MT dinamiklerinin in vivo analizine izin vermektedir. Örneğin, farelerde deri altından ksenograflanmış fibrosarkom hücrelerinde MTs’lerin gözlemlenmesi, tümörle ilişkili makrofajların tümör hücrelerinde MT dinamiklerini etkilediğini ortaya koymuştur15. Bununla birlikte, bu fare modelleri kapsamlı cerrahi prosedürler içerir ve yüksek derecede invaziv beyin tümörü GBM gibi daha az erişilebilir kanserler için tatmin edici değildir.
Kasvetli bir 15 aylık ortalama hayatta kalma süresi16’ya rağmen, GBM’nin beyin parankimi içindeki yayılma şekli veya beyin dokusunda GBM hücre invazyonunu sürdüren temel moleküler elementler hakkında çok az şey bilinmektedir. Fare ortotopik ksenogreft (PDX) modelindeki gelişmeler ve kraniyal pencerelerin kurulması GBM hücre invazyonu çalışmaları için yeni umutlar sunmuştur17,18. Bununla birlikte, yetersiz görüntüleme kalitesi nedeniyle, bu model çoğunlukla yüzeysel ksenogreftlerin uzunlamasına görüntülenmesine izin vermiş ve şimdiye kadar sitoiskelet proteinlerinin hücre altı görüntülemesini incelemek için başarılı bir şekilde kullanılmamıştır. Ayrıca, kemirgenlerin kullanımını azaltmak ve onları alt omurgalılarla değiştirmek için “3R” emrinin ardından, alternatif modeller oluşturulmuştur.
Zebra balığı (Danio rerio) larvalarında gözlenen ilkel bağışıklıktan yararlanarak, balık beynine GBM hücrelerinin ortotopik enjeksiyonu 19,20,21 geliştirilmiştir. Gelişmekte olan orta beyindeki ventriküllerin yakınına enjeksiyon, insan GBM patofizyolojisinin çoğunu özetler21 ve insan-damar ko-seçeneğinde olduğu gibi aynı tercih edilen GBM invazyonu paternigözlenir 22. Balık larvalarının şeffaflığı sayesinde, bu model, çoğu GBM’nin ortaya çıktığı düşünülen peri-ventriküler bölgelerden beyni istila eden GBM hücrelerinin görselleştirilmesine izin verir23.
MT’ler in vitro24,25 GBM hücre invazyonu için gerekli olduğundan, MT dinamiklerinin daha iyi bir karakterizasyonu ve hücre invazyonu sırasında anahtar düzenleyicilerin tanımlanması gereklidir. Bununla birlikte, bugüne kadar, zebra balığı ortotopik modeli ile üretilen veriler, istila işlemi sırasında MT dinamiklerinin hücre altı analizini içermemiştir. Bu makale, MT dinamiklerini in vivo olarak incelemek ve beyin kanseri invazyonu sırasındaki rolünü belirlemek için bir protokol sunmaktadır. Kararlı mikrotübül etiketlemesini takiben, GBM hücrelerine zebra balığı larvalarının beyinlerinde 3 dpf’de mikroenjekte edilir ve beyin dokusundaki ilerlemeleri sırasında yüksek uzaysal-zamansal çözünürlükte gerçek zamanlı olarak görüntülenir. Floresan MT’lerin canlı görüntülenmesi, MT artı uç dinamiklerinin kalitatif ve kantitatif analizini sağlar. Ayrıca, bu model MTA’ların MT dinamikleri ve GBM hücrelerinin invaziv özellikleri üzerindeki etkisini gerçek zamanlı olarak değerlendirmeyi mümkün kılar. Bu nispeten invaziv olmayan protokol, bir seferde ele alınan çok sayıda larva ve ilaç uygulama kolaylığı (balık suyunda) ile birleştiğinde, modeli klinik öncesi testler için bir varlık haline getirir.
Tümör ksenogreftlerinin tek hücre çözünürlüğünde görüntülenmesi, GBM biyolojisi hakkındaki anlayışımızı geliştirmek için vazgeçilmez bir araç haline gelecektir. Fare PDX modellerinde canlı görüntüleme, GBM’nin toplu olarak beyin dokusunu nasıl istila ettiğine dair değerli keşiflere yol açmıştır18. Bununla birlikte, bugüne kadar, uzaysal zamansal çözünürlük, GBM istilasını kontrol eden proteinlerin dinamiklerini ortaya çıkaracak kadar yüksek değildir. …
The authors have nothing to disclose.
Dr. P. Herbomel’e (Institut Pasteur, Fransa) ve laboratuvarına, özellikle Valérie Briolat ve Emma Colucci-Guyon’a, zebra balığı hatlarını ve mikroenjeksiyon plakaları için plastik kalıbı bize sağladıkları ve zebra balığı deney prosedürleri konusundaki değerli uzmanlıkları için son derece minnettarız. UtechS Fotonik BiyoGörüntüleme’ye (C2RT, Fransız Ulusal Araştırma Ajansı France BioImaging tarafından desteklenen Pasteur Enstitüsü ve ANR-10-INBS-04; Geleceğe Yönelik Yatırımlar). Bu çalışma Ligue contre le cancer (EL2017. LNCC), Centre National de la Recherche Scientifique ve Institut Pasteur ve Bayan Marguerite MICHEL ve Bay Porquet’in cömert bağışlarıyla.
Glioblastoma cell culture | |||
Foetal calf serum | Eurobio | CVFSVF00-01 | Reagent |
MEM NEAA | Gibco | 11140-050 | Reagent |
Modified Eagle's medium | Eurobio | CM1MEM18-01 | Reagent |
Penicillin–streptomycin | Gibco | 15140-122 | Reagent |
U-87 MG | ECACC | 89081402-1VL | Cells |
Lenitivirus production | |||
BD FACSAria III | BD bioscience | Instrument | |
BD FACSDiva software v8.0 | BD bioscience | Software | |
HEK-293T | Merck | 12022001 | Cells |
pMD2.G | Addgene | Plasmid #12259 | Reagent |
psPAX2 | Addgene | Plasmid #12260 | Reagent |
Ultracentrifuge Optima XPN-80 | Beckman Coulter | Instrument | |
Cell passaging and staining | |||
dPBS | Gibco | 14190-094 | Chemical |
Hoechst 34580 | Sigma-Aldrich | 63493 | Chemical |
Trypsin-EDTA (0,05%) | Gibco | 25300-054 | Reagent |
Zebrafish husbandry | |||
Fluorescence stereomicroscope LEICA M165FC | LEICA | https://www.leica-microsystems.com/fr/produits/stereomicroscopes-et-macroscopes/informations-detaillees/leica-m165-fc/ | Instrument |
Methylene Blue hydrate | Sigma-Aldrich | M4159 | Chemical |
N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629-25G | Chemical |
Transfer Pipettes fine tips | Samco Scientific | 232 | Equipment |
Transfer Pipettes Large Bulb3mL | Samco Scientific | 225 | Equipment |
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | Cat#: A5040 | Chemical |
Volvic Source Water | DUTSCHER DOMINIQUE SAS | 999556 | Reagent |
Xenotransplantation | |||
24-well plate | TPP | 92024 | Equipment |
Borosilicate glass capillaries (1.0 ODx0.58IDx150L mm) | Harvard Apparatus | (#30-0017 GC100-15 | Equipment |
CellTram oil vario microinjector | Eppendorf | 5176000.025 | Instrument |
Microloading pipet tips (Microloader) 20µL | Eppendorf | 5242956003 | Equipment |
Micromanipulator | NARISHIGE | https://products.narishige-group.com/group1/injection/english.html | Equipment |
Mineral Oil | Sigma | M8410-100ml | Equipment |
Stereomicroscope | Olympus | KL 2500 LCD | Instrument |
Universal capillary holder | Eppendorf | 5176190002 | Equipment |
Vertical Pipette puller | KOPF (Roucaire) | Model 720 | Instrument |
Intravital Imaging | |||
3.5cm glass-bottom videoimaging dish | MatTek Life Sciences, MA, USA | P35G-1,5-14-C | Equipment |
Acquisition software: NIS-Elements-AR version 5.21 | Nikon | Software | |
Heat-Block | Techne | DRI-BLOCK DB-2D | Equipment |
Microscope head Nikon Ti2E | Nikon | Instrument | |
sCMOS camera Prime 95B | Photometrics | Instrument | |
sCMOS camera Orca Flash 4 | Hammatsu | Instrument | |
Ultrapure Low melting point agarose | Invitrogen | 16520-050 | Chemical |
Yokagawa CSU-W1 spinning disk unit | Hammatsu | Instrument | |
Drug Treatment | |||
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | Chemical |
Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404-2MG | Chemical |
Image Analysis | |||
Imaris 9.5.1 software | Oxford Instruments | Software | |
ImarisFileConverter 9.5.1 | Oxford Instruments | Software |