MRI、組織透明化、ライトシート顕微鏡を用いた無傷新生児マウス脳の全脳単一細胞イメージングと解析
Summary
このプロトコルでは、iDISCO+を使用して無傷のマウス脳の磁気共鳴イメージング、クリアリング、および免疫標識を行う方法について説明し、その後、ライトシート顕微鏡を使用したイメージングの詳細な説明、およびNuMorphを使用したダウンストリーム分析について説明します。
Abstract
組織透明化とそれに続くライトシート顕微鏡(LSFM)により、無傷の脳構造の細胞分解能イメージングが可能になり、遺伝的または環境的摂動によって引き起こされる構造変化の定量的分析が可能になります。全脳イメージングは、細胞のより正確な定量化と、物理的に切片化された組織の一般的に使用される顕微鏡では見逃される可能性のある領域特異的な違いの研究をもたらします。ライトシート顕微鏡を使用してクリアされた脳を画像化すると、共焦点顕微鏡と比較して取得速度が大幅に向上します。これらの画像は非常に大量の脳構造データを生成しますが、除去された組織の画像で特徴の定量化を実行するほとんどの計算ツールは、すべての核ではなく、まばらな細胞集団のカウントに限定されています。
ここでは、分析ツールのグループであるNuMorph(核ベースの形態測定)を示し、生後4日目(P4)マウスの脳のアノテーション領域内のすべての核および核マーカーを、ライトシート顕微鏡でクリアしてイメージングした後、定量化します。組織クリアの脱水ステップによって引き起こされる収縮前の脳容積を測定する磁気共鳴画像法(MRI)、免疫標識を含むiDISCO+法を使用した組織クリアリング、続いて市販のプラットフォームを使用してマウスの脳を細胞解像度で画像化するライトシート顕微鏡について説明します。次に、強度差の修正、画像タイルのステッチ、複数のチャネルの整列、核のカウント、公開されているアトラスへの登録による脳領域の注釈付けに使用されるNuMorphを使用したこの画像分析パイプラインを示します。
このアプローチは、公開されているプロトコルとソフトウェアを使用して設計され、必要な顕微鏡と計算リソースを持つすべての研究者がこれらの手法を実行できるようにしました。これらの組織クリアリング、イメージング、および計算ツールは、皮質内の細胞タイプの3次元(3D)組織の測定と定量化を可能にし、あらゆる野生型/ノックアウトマウス研究デザインに広く適用できるはずです。
Introduction
単一細胞分解能での全脳イメージングは、神経科学における重要な課題です。細胞解像度の脳画像は、脳回路の詳細な分析とシステムレベルのマッピングを可能にし、その回路が神経精神障害の遺伝的または環境的危険因子、発生中の胚の細胞挙動、および成人脳の神経回路によってどのように破壊されるかを可能にします1,2,3。再構築された3D脳の高解像度画像を可能にする複数の組織学的方法があります。しかしながら、これらの技術は、高価で特殊な装置を必要とし、免疫標識と互換性がない場合があり、そしていくつかの方法の2次元(2D)性質は、切片化中の組織損傷および剪断をもたらし得る4、5。
最近の進歩は、組織切片を必要としない脳全体を画像化するための代替アプローチを提供しました。それらは、脳を透明にするために組織クリアリングを使用することを含みます。ほとんどの組織透明化法では、光散乱の主要な光源である脂質を除去し、イメージング中に目的の屈折率(RI)をサンプル浸漬溶液のRIと一致させることによって、透明性が達成されます。その後、光は散乱されることなく材料間の境界を通過することができます6、7、8、9。
iDISCO+などの組織クリアリング法は、LSFM 6,7,10などの単一光子励起顕微鏡を用いた迅速な3Dイメージングと組み合わせることがよくあります。蛍光色素で標識した透明組織内で、光の薄い平面11で励起することにより光シート蛍光顕微鏡画像切片を画像化する。LSFMの主な利点は、一度に1つの光学セクションが照らされ、そのセクション内の分子からのすべての蛍光が励起され、光退色が最小限に抑えられることです。さらに、光学スライス全体を画像化することで、その励起スライスのカメラベースの検出が可能になり、ポイントスキャン12に対して速度が増加する。LSFMは、3D再構成に適した十分に登録された光学セクションを非破壊で生成します。
iDISCO+法は~3週間以内に安価な組織透明化を可能にしますが、プロトコル内の脱水ステップは、組織の収縮とサンプル形態の潜在的な変化につながる可能性があり、したがって体積測定に影響を与える可能性があります6,10。組織クリアリング手順の前に使用するMRIなどの二次イメージング法を追加すると、サンプル全体の組織クリアリング誘発収縮の程度を測定できます。脱水ステップでは、灰白質と白質の機械的特性の違いが脳物質の不均一な変形を引き起こし、野生型サンプルと変異型サンプルの間で異なる組織透明化誘発体積変形を引き起こし、これらのサンプルの体積差の解釈を混乱させる可能性があります10,13.MRIは、まず動物を造影剤(例えば、ガドリニウム)で灌流し、続いて、画像化14の前に、目的の抽出された組織を浸漬溶液(例えば、フォンブリン)中でインキュベートすることによって行われる。MRIは、同じサンプルで組織を透明化し、LSFMを実行することと互換性があります。
LSFMは、脳構造の定量的評価ではなく、目的の脳組織を定性的に視覚化するための大規模な顕微鏡画像を作成するためによく使用されます(図1)。定量的評価がなければ、遺伝的または環境的侮辱に起因する構造の違いを実証することは困難です。組織透明化およびイメージング技術が向上し、ストレージと計算能力のコストが削減されるにつれて、関心のある組織内の細胞タイプの局在を定量化することがよりアクセスしやすくなり、より多くの研究者がこれらのデータを研究に含めることができます。
マウスの脳内の1億個以上の細胞15と、テラバイトのデータを生成できる全脳イメージングセッションにより、細胞などの画像内の特徴を正確に定量化できる高度な画像解析ツールの需要が高まっています。核染色強度の閾値を適用し、事前定義された形状、サイズ、または密度10、16、17、18でオブジェクトをフィルタリングする、組織クリア画像には多数のセグメンテーション方法が存在します。ただし、結果の不正確な解釈は、セルサイズ、画像のコントラスト、標識強度などのパラメーターの変動から発生する可能性があります。この論文では、マウス脳内の細胞核を定量するための確立されたプロトコルについて説明します。まず、P4マウス脳の組織採取の手順を詳しく説明し、続いて、公開されているiDISCO+メソッド10から最適化された組織クリアリングおよび免疫標識プロトコルについて説明します。次に、MRIとライトシート顕微鏡を使用した画像取得について、画像のキャプチャに使用されるパラメーターを含めて説明します。最後に、組織クリアリング後の細胞種特異的定量、核マーカーによる免疫標識、アノテーション領域のライトシートイメージングを可能にする、当グループが開発した画像解析ツールのセットであるNuMorph19について説明し、デモンストレーションします。
Protocol
Representative Results
Discussion
組織透明化法は、脳の3D細胞組織を測定するための有用な技術である。文献に記載されている多数の組織透明化方法があり、それぞれに利点と制限があります6、7、8、9。組織クリア画像内の細胞タイプを分析するための計算ツールの選択肢は比較的限られています。他の利用可能なツールは、セ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、NIH(R01MH121433、R01MH118349、およびR01MH120125からJLSおよびR01NS110791からGW)と財団の支援を受けました。サンプルイメージングを支援してくれた顕微鏡サービスラボのPablo Arielに感謝します。病理学および検査医学部門の顕微鏡サービスラボは、ノースカロライナ大学(UNC)ラインバーガー総合がんセンターへのがんセンターコアサポート助成金P30 CA016086によって部分的にサポートされています。神経科学顕微鏡コアは、助成金P30 NS045892によってサポートされています。この出版物で報告された研究は、ノースカロライナバイオテクノロジーセンターの制度的支援助成金2016-IDG-1016によって部分的にサポートされています。
Materials
| Bruker 9.4T/30 cm MRI Scanner | Bruker Biospec | Horizontal Bore Animal MRI System | |
| Dibenzyl ether | Sigma-Aldrich | 108014-1KG | |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997-1L | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher-Scientific | ICN19605590 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | S30-100ML | |
| EVO 860 4TB external SSD | |||
| Fomblin Y | Speciality Fluids Company | YL-VAC-25-6 | perfluoropolyether lubricant |
| gadolinium contrast agent (ProHance) | Bracco Diagnostics | A9576 | |
| gadolinium contrast agent(ProHance) | Bracco Diagnostics | 0270-1111-03 | |
| GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPU | EVGA | 08G-P4-6286-KR | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126-500G | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393-10KU | Dissolved in H2O to 10 mg/mL |
| Hydrogen peroxide solution, 30% | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | |
| ImSpector Pro | LaVision BioTec | Microscope image acquisition software | |
| ITK Snap | segmentation software | ||
| Methanol | Fisher-Scientific | A412SK-4 | |
| MVPLAPO 2x/0.5 NA Objective | Olympus | ||
| Paraformaldehyde, powder, 95% (PFA) | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Dissolved in 1x PBS to 4% |
| Phosphate Buffered Saline 10x (PBS) | Corning | 46-013-CM | Diluted to 1x in H2O |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002-100G | Dissolved in H2O to 10% |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-10G | |
| Tergitol type NP-40 | Sigma-Aldrich | NP40S-100ML | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | |
| Tween-20 | Fisher-Scientific | BP337 500 | |
| Ultramicroscope II Light Sheet Microscope | LaVision BioTec | ||
| Xeon Processor E5-2690 v4 | Intel | E5-2690 | |
| Zyla sCMOS Camera | Andor | Complementary metal oxide semiconductor camera | |
| Antibody | Working concentration | ||
| Alexa Fluor Goat 790 Anti-Rabbit | Thermofisher Scientific | A11369 | (1:50) |
| Alexa Fluor Goat 568 Anti-Rat | Thermofisher Scientific | A11077 | (1:200) |
| Rat anti-Ctip2 | Abcam | ab18465 | (1:400) |
| Rabbit anti-Brn2 | Cell Signaling Technology | 12137 | (1:100) |
| To-Pro 3 (TP3) | Thermofisher Scientific | T3605 | (1:400) |
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