Peel-Blot-teknikken: En Cryo-EM-prøveforberedelsesmetode til adskillelse af enkeltlag fra flerlags eller koncentrerede biologiske prøver

Summary

Peel-blot-teknikken er en cryo-EM-gitterforberedelsesmetode, der gør det muligt at adskille flerlags og koncentrerede biologiske prøver i enkeltlag for at reducere tykkelsen, øge prøvekoncentrationen og lette billedbehandlingen.

Abstract

Peel-blot cryo-EM-gitterforberedelsesteknikken er en signifikant modificeret tilbageinjektionsmetode med det formål at opnå en reduktion i lag af flerlagsprøver. Denne fjernelse af lag inden nedfrysning kan hjælpe med at reducere prøvetykkelsen til et niveau, der er egnet til cryo-EM-dataindsamling, forbedre prøvefladheden og lette billedbehandling. Peel-blot-teknikken gør det muligt at adskille multilamellarmembraner i enkeltlag, af lagdelte 2D-krystaller i individuelle krystaller og af stablede, arklignende strukturer af opløselige proteiner, der ligeledes kan adskilles i enkeltlag. Den høje prøvetykkelse af disse typer prøver udgør ofte uoverstigelige problemer for cryo-EM-dataindsamling og cryo-EM-billedbehandling, især når mikroskoptrinnet skal vippes for dataindsamling. Desuden kan gitre med høje koncentrationer af nogen af disse prøver forberedes til effektiv dataindsamling, da prøvekoncentrationen inden gitterforberedelse kan øges, og peel-blot-teknikken justeres for at resultere i en tæt fordeling af enkeltlagsprøve.

Introduction

Peel-blot-teknikken blev udviklet for at adskille stablede todimensionelle krystaller af membranproteiner i enkeltlag for at opnå passende tynde prøver til cryo-EM 2D- og 3D-dataindsamling og lette billedbehandling¹. Protokollen er ligeledes velegnet til andre typer multilamellare prøver samt til at opnå høje prøvekoncentrationer af begge prøvetyper på gitteret uden at øge tykkelsen i Z.

Reduktion af prøvelag til et lag opnås ved at anvende en kombination af kapillærtryk og forskydningskræfter i en protokol, der væsentligt udvider og ændrer ryginjektionsmetoden². Et første blottingtrin resulterer i tæt sandwiching og vedhæftning af carbonfilmen og en gitterstang på hver side af flerlagsprøven under blotting på submikron i stedet for 20-25 μm filterpapirporestørrelse i tilbageinjektionsmetoden. Adskillelsen eller afskalningen af et individuelt lag sker ved at tvinge adskillelsen af de klemte lag, når gitteret presses lodret på et trehalosefald, hvilket tvinger carbonfilmen væk fra gitterbjælken (figur 1). Omplacering af carbonfilmen væk fra det oprindelige kontaktpunkt med gitterbjælken sker i næste trin, når gitteret igen blottes på submikronfilterpapir. Antallet af gentagelser af disse trin kan optimeres til specifikke prøver. Desuden kan protokollen bruges til at øge prøvekoncentrationerne og samtidig undgå aggregering i Z. På grund af afhængigheden af overholdelse af gitterbjælken og carbonfilmen samt kraftig adskillelse er denne tilgang muligvis ikke egnet til meget skrøbelige molekyler såsom visse sarte og / eller ustabile proteiner og proteinkomplekser.

Peel-blot-teknikken kræver hverken specialudstyr eller dyre forsyninger. Anvendelighed på specifikke prøver vil dog kræve nøje overvejelser om biologiske parametre. Beslutningen er lettere for 2D-krystaller, da kulstoffilm er nødvendig for at sikre fladhed, men manipulation via peel-blot-teknikken kan påvirke prøvens biologiske integritet eller krystallinske rækkefølge. Peel-blot-teknikkens egnethed til enkeltpartikler er begrænset til og kan testes for dem, der kræver kulstoffilm og er stabile over for manipulation. Prøver med kritiske biologiske interaktioner mellem lag er muligvis ikke egnede til karakterisering ved hjælp af skrælblot-teknikken på grund af forstyrrelsen af sådanne interaktioner.

Peel-blot-teknikken (“peel-blot”) optimeres hurtigst ved at teste og screene med negativ plet eller ufarvede prøver ved TEM ved stuetemperatur. Når det optimale antal peel-blot-iterationer er blevet identificeret, kan tiden til at kontrollere tykkelsen før forglasning bestemmes.

Protocol

1. Forberedelsestrin til skrælblot-teknikken BEMÆRK: Forberedelse kræver, at følgende genstande placeres ved siden af hinanden. Stak to stykker filterpapir i porestørrelse på 20-25 μm (se Materialetabel). Placer en ~8 cm x 10 cm lang paraffinfilm ved siden af filterpapiret med papiret opad. Placer et stykke submikronfilterpapir oven på yderligere to stykker #4 filterpapir (figur 1-1</s…

Representative Results

Et vellykket peel-blot-eksperiment vil resultere i enkeltlag af prøver i ofte høje koncentrationer. Det kan forventes, at nogle regioner i de fleste gitterkvadrater stadig vil indeholde flere lag, især ved færre antal iterationer af skrælblot-trinnene. Størstedelen af gitterkvadrater vil imidlertid indeholde omfattende regioner af enkeltlag som observeret for 2D-krystaller af human leukotrien C 4-syntase (figur 2) og liposomer (tilføjet i trin 3.2, figur 3).<strong class="x…

Discussion

Peel-blot er en kraftfuld metode til at overvinde stabling og tykkelse af flerlags 2D-krystaller og lignende prøver til cryo-EM-dataindsamling og billedbehandling. En beslutning om brugen af peel-blot vil være baseret på biologiske parametre i prøven og vil også kræve vurdering, når en 3D cryo-EM-model er tilgængelig. Den biologiske betydning af kontakter og kontaktregionernes potentielle fleksibilitet vil være særlig vigtig i denne vurdering.

Antallet af skrælpletter vil i første …

Materials

600-mesh grids	SPI	2060-C-XA
Anti-capillary forceps	Ted Pella	510-5
Carbon to coat mica
Cryo-EM			Cryo-EM grids may be screened at 120 kV or 200 kV.  High-resolution data is collected at 300 kV.
Dumpont #5 forceps	Ted Pella	5622
Grid box for cryo-EM storage	Ted Pella	160-40
Kim Wipes
Liquid nitrogen
Mica	Ted Pella	56	The mica is carbon-coated and cut into squares that are slighlty larger than a TEM grid.  The carbon thickness may require optimization to avoid thin carbon that breaks easily upon multiple peel blots.
Negative stain			1-2% uranyl acetate is suitable for many samples.  Other stains such as phosphotungstic acid can be substituted.
Parafilm
Polystyrene container			Used for vitrifying the peel-blot grid. A polystyrene shipping container can be recycled for this purpose and lined with aluminium foil.
Submicron filter paper	MilliporeSigma	DAWP04700
Transmission electron microscope	JEOL	JEM-1400	Any TEM operated at an accelerating voltage of 80-120 kV will be suitable for screening of negatively stained grids.
Trehalose			Prepare 4% trehalose solution.
Whatman #4 filter paper	MilliporeSigma	WHA1004150	This corresponds to the 20-25 μm pore size filter paper in the protocol.