Peel-blot-teknikken: En Cryo-EM-prøveprepareringsmetode for å skille enkeltlag fra flerlags eller konsentrerte biologiske prøver

Summary

Peel-blot-teknikken er en cryo-EM-gridpreparasjonsmetode som gjør det mulig å skille flerlags og konsentrerte biologiske prøver i enkeltlag for å redusere tykkelsen, øke prøvekonsentrasjonen og lette bildebehandlingen.

Abstract

Peel-blot cryo-EM gridpreparasjonsteknikken er en betydelig modifisert tilbakeinjeksjonsmetode med sikte på å oppnå en reduksjon i lag med flerlagsprøver. Denne fjerningen av lag før dypping kan bidra til å redusere prøvetykkelsen til et nivå som er egnet for innsamling av kryo-EM-data, forbedre prøveflatheten og lette bildebehandlingen. Peel-blot-teknikken tillater separasjon av multilamellære membraner i enkeltlag, av lagdelte 2D-krystaller i individuelle krystaller, og av stablede, arklignende strukturer av oppløselige proteiner som også skal separeres i enkeltlag. Den høye prøvetykkelsen på denne typen prøver utgjør ofte uoverstigelige problemer for cryo-EM-datainnsamling og cryo-EM-bildebehandling, spesielt når mikroskoptrinnet må vippes for datainnsamling. Videre kan gitter med høye konsentrasjoner av noen av disse prøvene fremstilles for effektiv datainnsamling, siden prøvekonsentrasjonen før klargjøring av rutenettet kan økes og peel-blot-teknikken justeres for å resultere i en tett fordeling av enkeltlagsprøver.

Introduction

Peel-blot-teknikken ble utviklet for å skille stablede todimensjonale krystaller av membranproteiner i enkeltlag for å oppnå passende tynne prøver for kryo-EM 2D- og 3D-datainnsamling og lette bildebehandling¹. Protokollen er tilsvarende egnet for andre typer multilamellære prøver, samt for å oppnå høye prøvekonsentrasjoner av begge prøvetyper på rutenettet uten å øke tykkelsen i Z.

Reduksjon av prøvelag til ett lag oppnås ved å påføre en kombinasjon av kapillærtrykk og skjærkrefter i en protokoll som vesentlig strekker seg på og endrer tilbakeinjeksjonsmetoden². Et første blotting-trinn resulterer i tett sandwiching og overholdelse av karbonfilmen og en gitterstang på hver side av flerlagsprøven under blotting på submikron i stedet for 20-25μm filterpapirporestørrelse i tilbakeinjeksjonsmetoden. Separasjonen, eller peeling, av et enkelt lag skjer ved å tvinge separasjonen av de sammenklemte lagene når rutenettet presses vertikalt på en trehalosefall, og tvinger karbonfilmen bort fra rutenettstangen (figur 1). Flytting av karbonfilmen bort fra det opprinnelige kontaktpunktet med rutenettet skjer i neste trinn, når rutenettet igjen er blottet på submikronfilterpapir. Antall gjentakelser av disse trinnene kan optimaliseres for bestemte prøver. Videre kan protokollen brukes til å øke prøvekonsentrasjonene samtidig som aggregering i Z. På grunn av avhengigheten av overholdelse av gitterstangen og karbonfilmen, samt kraftig separasjon, kan denne tilnærmingen ikke være egnet for svært skjøre molekyler som visse delikate og / eller ustabile proteiner og proteinkomplekser.

Peel-blot-teknikken krever verken spesialutstyr eller dyre forsyninger. Anvendelse på spesifikke prøver vil imidlertid kreve nøye vurderinger av biologiske parametere. Beslutningen er lettere for 2D-krystaller, da karbonfilm er nødvendig for å sikre flathet, men manipulering via peel-blot-teknikken kan påvirke den biologiske integriteten til prøven eller krystallinsk rekkefølge. Egnetheten til peel-blot-teknikken til enkeltpartikler er begrenset til og kan testes for de som krever karbonfilm og er stabile for manipulering. Prøver med kritiske biologiske interaksjoner mellom lag kan ikke være egnet for karakterisering ved hjelp av peel-blot-teknikken på grunn av forstyrrelsen av slike interaksjoner.

Peel-blot-teknikken (“peel-blot”) optimaliseres raskest ved testing og screening med negativ flekk eller ufargede prøver av TEM ved romtemperatur. Når det optimale antallet peel-blot-iterasjoner er identifisert, kan tiden for å kontrollere tykkelsen før vitrifisering bestemmes.

Protocol

1. Forberedelsestrinn for peel-blot-teknikken MERK: Forberedelse krever at følgende elementer plasseres ved siden av hverandre. Stable to stykker av 20-25 μm pore størrelse filter papir (se tabell over materialer). Plasser en ~8 cm x 10 cm lang parafinfilm ved siden av filterpapiret med papiret vendt opp. Legg et stykke submikronfilterpapir på toppen av to ekstra stykker # 4 filterpapir (figur <st…

Representative Results

Et vellykket peel-blot-eksperiment vil resultere i enkeltlag med prøver i ofte høye konsentrasjoner. Det er å forvente at noen regioner i de fleste rutenettfirkanter fortsatt vil inneholde flere lag, spesielt ved færre antall iterasjoner av peel-blot-trinnene. De fleste rutenettkvadrater vil imidlertid inneholde store områder av enkeltlag som observert for 2D-krystaller av human leukotrien C 4-syntase (figur 2) og liposomer (lagt til i trinn 3.2, figur 3).<strong class="xfig"…

Discussion

Peel-blot er en kraftig metode for å overvinne stabling og tykkelse av flerlags 2D-krystaller og lignende prøver for kryo-EM-datainnsamling og bildebehandling. En beslutning om bruk av peel-blot vil være basert på biologiske parametere i prøven og vil også kreve vurdering når en 3D cryo-EM-modell er tilgjengelig. Den biologiske betydningen av kontakter og potensiell fleksibilitet i kontaktregioner vil være særlig viktig i denne vurderingen.

Antallet peel-blots vil i utgangspunktet bli…

Materials

600-mesh grids	SPI	2060-C-XA
Anti-capillary forceps	Ted Pella	510-5
Carbon to coat mica
Cryo-EM			Cryo-EM grids may be screened at 120 kV or 200 kV.  High-resolution data is collected at 300 kV.
Dumpont #5 forceps	Ted Pella	5622
Grid box for cryo-EM storage	Ted Pella	160-40
Kim Wipes
Liquid nitrogen
Mica	Ted Pella	56	The mica is carbon-coated and cut into squares that are slighlty larger than a TEM grid.  The carbon thickness may require optimization to avoid thin carbon that breaks easily upon multiple peel blots.
Negative stain			1-2% uranyl acetate is suitable for many samples.  Other stains such as phosphotungstic acid can be substituted.
Parafilm
Polystyrene container			Used for vitrifying the peel-blot grid. A polystyrene shipping container can be recycled for this purpose and lined with aluminium foil.
Submicron filter paper	MilliporeSigma	DAWP04700
Transmission electron microscope	JEOL	JEM-1400	Any TEM operated at an accelerating voltage of 80-120 kV will be suitable for screening of negatively stained grids.
Trehalose			Prepare 4% trehalose solution.
Whatman #4 filter paper	MilliporeSigma	WHA1004150	This corresponds to the 20-25 μm pore size filter paper in the protocol.