यहां, माउस ऊतकों के विकास में साइटोनेम्स नामक विशेष सिग्नलिंग फिलोपोडिया का पता लगाने के लिए भ्रूण के निर्धारण, इम्यूनोस्टेनिंग और सेक्शनिंग के लिए एक अनुकूलित चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रदान किया जाता है।
विकासात्मक ऊतक पैटर्निंग और पोस्टडेवलपमेंटल ऊतक होमियोस्टेसिस मॉर्फोजेन नामक सेलुलर संकेतों के नियंत्रित वितरण पर निर्भर करते हैं। मॉर्फोजेन अलग-अलग ट्रांसक्रिप्शनल कार्यक्रमों को निर्दिष्ट करने के लिए एक एकाग्रता- और समय-निर्भर तरीके से कार्य करते हैं जो सेल भाग्य को निर्देश और सुदृढ़ करते हैं। एक तंत्र जिसके द्वारा उपयुक्त मॉर्फोजेन सिग्नलिंग थ्रेसहोल्ड सुनिश्चित किया जाता है, साइटोनेम्स नामक विशेष फिलोपोडिया द्वारा सिग्नलिंग प्रोटीन के वितरण के माध्यम से होता है। साइटोनेम बहुत पतले होते हैं (व्यास में ≤200 एनएम) और कई सौ माइक्रोन की लंबाई तक बढ़ सकते हैं, जो निश्चित छवि विश्लेषण के लिए उनके संरक्षण को चुनौतीपूर्ण बनाता है। यह पेपर मानक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके साइटोनेम्स के दृश्य की अनुमति देने के लिए निर्धारण, इम्यूनोस्टेनिंग और मोटी सेक्शनिंग के लिए माउस भ्रूण के नाजुक हैंडलिंग के लिए एक परिष्कृत विधि का वर्णन करता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग माउस तंत्रिका ट्यूब विकास के दौरान अलग-अलग सेलुलर सिग्नलिंग डिब्बों को जोड़ने वाले साइटोनेम्स की कल्पना करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है। तकनीक को अभूतपूर्व संकल्प पर विकासात्मक सिग्नलिंग की पूछताछ की सुविधा के लिए ऊतक प्रकारों में साइटोनेम का पता लगाने के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है।
भ्रूण के विकास को मॉर्फोजेन सिग्नलिंग मार्गों के समन्वित सक्रियण के माध्यम से ऑर्केस्ट्रेटेड किया जाता है। मॉर्फोजेन छोटे, स्रावित प्रोटीन होते हैं जिन्हें सोनिक हेजहोग (एसएचएच) में वर्गीकृत किया जाता है, जो विकास कारक β (टीजीएफ -β) / हड्डी मॉर्फोजेनिक प्रोटीन (बीएमपी), विंगलेस से संबंधित एकीकरण साइट (डब्ल्यूएनटी), और फाइब्रोब्लास्ट और एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (एफजीएफ / मॉर्फोजेन का उत्पादन और ऊतक विकास के दौरान सेलुलर आयोजन केंद्रों से जारी किया जाता है और ऊतक मॉर्फोजेनेसिस 1,2,3,4,5 को सूचित करने के लिए कोशिकाओं के आयोजन क्षेत्रों में सिग्नलिंग ग्रेडिएंट स्थापित किया जाता है। मॉर्फोजेन ग्रेडिएंट्स का एक प्रतिनिधित्व विकासशील तंत्रिका तंत्र में पाया जाता है, जहां अनुमानित केंद्रीय तंत्रिका तंत्र को मॉर्फोजेन मार्ग सक्रियण के माध्यम से पैटर्न किया जाता है। यह ऊतक, जिसे तंत्रिका ट्यूब के रूप में जाना जाता है, में उदर-सबसे नोटोकॉर्ड और फर्श प्लेट द्वारा स्रावित एसएचएच के विरोधी ढाल शामिलहैं, और पृष्ठीय छतप्लेट से स्रावित डब्ल्यूएनटी / तंत्रिका ट्यूब का उपयोग आमतौर पर विकासात्मक अनुसंधान में मॉर्फोजेन ढाल अखंडता से पूछताछ करने के लिए किया जाता है।
मॉर्फोजेन ढाल गठन सिग्नल फैलाव7 के तंग विनियमन पर निर्भर करता है। एक सेलुलर तंत्र जिसके द्वारा ऐसा होता है, लंबे सिग्नलिंग फिलोपोडिया के गठन के माध्यम से होता है जिसे साइटोनेम्स कहा जाता है जो सिग्नल-उत्पादक कोशिकाओं से विशिष्ट लक्ष्य सेल आबादी तक मॉर्फोजेन के प्रत्यक्ष वितरण की सुविधा प्रदान करता है। साइटोनेम्स को सिग्नल प्राप्त करने वाले सेल झिल्ली 8,9 पर मॉर्फोजेन जमा करने के लिए सैकड़ों माइक्रोमीटर का विस्तार करनेके लिए देखा गया है। साइटोनेम-मध्यस्थता वाले मॉर्फोजेन परिवहन के विघटन से मक्खियों और कशेरुकियों दोनों में विकासात्मक विसंगतियां होती हैं, जो ऊतक पैटर्निंग10,11,12,13,14 के दौरान उनके महत्व को उजागर करती हैं।
आज तक, साइटोनेम्स को ड्रोसोफिला, चिक और ज़ेब्राफिश मॉडल में प्रलेखित किया गया है, लेकिन स्तनधारी भ्रूण के विकास में संरचनाओं की इमेजिंग 8,9,15 को चुनौतीपूर्ण बना हुआ है। सीटू में जटिल स्तनधारी ऊतकों में साइटोनेम्स को प्रभावी ढंग से इमेजिंग करने के लिए एक बाधा उनकी पतली और नाजुक प्रकृति है, जो उन्हें पारंपरिक निर्धारण विधियों द्वारा नुकसान के लिए अतिसंवेदनशील बनाती है8. हमने पहले सुसंस्कृत कोशिकाओं में साइटोनेम्स को संरक्षित करने और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी16,17 का उपयोग करके उनके अध्ययन को सक्षम करने के लिए संशोधित इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी फिक्सेटिव (एमईएम-फिक्स) के लिए प्रोटोकॉल विकसित और अनुकूलित किया था।
एमईएम-फिक्स तकनीक के उपयोग ने एसएचएच-प्रेरित साइटोनीम गठन और फ़ंक्शन 11,16,17 में शामिल कुछ अणुओं की पहचान की अनुमति दी है। हालांकि, तंत्रिका ट्यूब पैटर्निंग के शारीरिक रूप से प्रासंगिक संदर्भ में इन निष्कर्षों की पुष्टि ने माउस भ्रूण के ऊतकों को ठीक करने और छवि बनाने के लिए उपन्यास तकनीकों के विकास की आवश्यकता की। माउस भ्रूण को इस तरह से ठीक करने के लिए एक प्रोटोकॉल जो साइटोनेम अखंडता को बनाए रखता है और कन्फोकल विश्लेषण के लिए भ्रूण के ऊतकों के इम्यूनोस्टेनिंग और बाद के सेक्शनिंग की अनुमति देता है, यहां उल्लिखित है। यह प्रोटोकॉल विकासशील तंत्रिका ट्यूब में एसएचएच-उत्पादक कोशिकाओं से झिल्ली एक्सटेंशन को लेबल करने के लिए झिल्ली-टेथर्ड ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) का उपयोग करके विकसित किया गया था। इस प्रोटोकॉल के कार्यान्वयन से स्तनधारी प्रणालियों के विकास में साइटोनेम्स के प्रसार और महत्व से संबंधित अनुत्तरित प्रश्नों को संबोधित किया जाएगा।
इस प्रोटोकॉल उच्च संकल्प प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए भ्रूण ऊतक वर्गों में नाजुक साइटोनेम के संरक्षण के लिए विकसित किया गया था। आज तक, विभिन्न मॉडल जीवों में ऊतक में साइटोनेम्स का दृश्य काफी हद तक लाइव-टिशू इमेजिंग का उपयोग करके फ्लोरोसेंटली लेबल वाले प्रोटीन की एक्टोपिक अभिव्यक्ति पर निर्भर करता है। दुर्भाग्य से, फ्लोरोसेंटली लेबल वाले लाइव-इमेजिंग का उपयोग अंतर्जात रूप से व्यक्त प्रोटीन के विश्लेषण के लिए शायद ही कभी अनुकूल होता है, समय की कमी का परिचय दे सकता है, और विशेष इमेजिंग चरणों और माइक्रोस्कोप की आवश्यकता होती है। यहां वर्णित धुंधला और सेक्शनिंग विधि अंतर्जात रूप से व्यक्त प्रोटीन के अंतिम पता लगाने के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री की अनुमति देने के लिए साइटोनेम्स और अन्य सेलुलर एक्सटेंशन को संरक्षित करती है। यह तकनीक विवो में विभिन्न ऊतकों में मॉर्फोजेन को कैसे ले जाया जाता है, इस बारे में नई अंतर्दृष्टि की सुविधा प्रदान करेगी और मॉडल सिस्टम के दायरे का विस्तार करेगी जहां साइटोनेम्स का अध्ययन किया जा सकता है।
यह प्रोटोकॉल पूरे माउंट धुंधला और वाइब्रेटोम मोटी-सेक्शनिंग का उपयोग करता है, जो सुक्रोज जैसे ग्लिसरॉल या क्रायोप्रोटेक्टेंट समाधान जैसे संतुलन समाधान के उपयोग से बचता है। इसका उद्देश्य सेलुलर एक्सटेंशन के अधिकतम संरक्षण की अनुमति देने के लिए खंडित ऊतक हैंडलिंग को कम करना है। सेक्शनिंग के बाद ऊतक की कम हैंडलिंग साइटोनेम्स के समग्र संरक्षण में लगातार बेहतर परिणाम प्रदान करती है। इस प्रकार, भ्रूण का सेक्शनिंग इमेजिंग से पहले अंतिम चरणों में से एक है।
एमईएम-फिक्स, सुसंस्कृत कोशिकाओं के साइटोनेम के संरक्षण के लिए विकसित एक निर्धारण तकनीक, ग्लूटाराल्डिहाइड और पीएफए का एक संयोजन होता है जो उनके जीवित आयामों16,17 की तुलना में जन्मजात सेल वास्तुकला के बेहतर 3 डी संरक्षण की अनुमति देता है। दुर्भाग्य से, एमईएम-फिक्स भ्रूण निर्धारण के लिए उपयोगी नहीं था क्योंकि ग्लूटाराल्डिहाइड ऑटो-फ्लोरोसिस कर सकता है और उच्च प्रोटीन क्रॉस-लिंकिंग गतिविधि22,23 के कारण कोशिकाओं में एंटीबॉडी प्रवेश और एपिटोप बाइंडिंग को गंभीर रूप से सीमित कर सकता है। इस प्रकार, भ्रूण के ऊतकों में सेलुलर एक्सटेंशन के संरक्षण की अनुमति देने के लिए पीएफए निर्धारण स्थितियों के बाद सेक्शनिंग प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया गया था। यद्यपि पीएफए भ्रूण के ऊतकों में साइटोनेम जैसे एक्सटेंशन को संरक्षित कर सकता है, छवि विश्लेषण सावधानी के साथ किया जाना चाहिए। पीएफए व्यक्तिगत कोशिकाओं और ऊतकों के आंशिक निर्जलीकरण का कारण बन सकता है, जिससे मामूली मात्रा में कमी और निश्चित ऊतक के भीतर छोटे बाह्य रिक्त स्थान का गठन हो सकता है।
सुक्रोज या ग्लिसरॉल समाधान ऊतक24 की एक मामूली पुनरावृत्ति का कारण बन सकता है क्योंकि इस प्रोटोकॉल क्रायोप्रोटेक्शन और ऊतक समाशोधन के लिए सुक्रोज पुनर्संतृप्ति के अतिरिक्त चरणों से बचा जाता है। परिणामस्वरूप मामूली सूजन कोशिकाओं के बीच और ऊतकों में पलायन करने वाले निश्चित सेलुलर एक्सटेंशन और साइटोनेम को नष्ट कर सकती है। क्रायोस्टैट वर्गों के लिए मोटी-खंडित वाइब्रेटोम की तुलना करते समय यह स्पष्ट था। यद्यपि ऊतक की मोटाई बढ़ने से बरकरार साइटोनेम के संरक्षण में सुधार हुआ, सुक्रोज-पुनर्संतृप्त क्रायोस्टैट वर्गों में लगातार पता लगाने योग्य साइटोनेम की कम घटनाएं थीं।
इस प्रोटोकॉल के अनुकूलन से पता चला है कि बरकरार साइटोनेम के संरक्षण को सुनिश्चित करने के लिए 100 μm मोटी वर्गों सबसे अच्छा थे। पतले वर्गों का उपयोग आमतौर पर इमेजिंग के लिए किया जाता है क्योंकि अधिकांश कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप केवल25 समाशोधन के बिना ~ 20-40 μm की गहराई तक सेलुलर एक्सटेंशन की कल्पना करने के लिए पर्याप्त रिज़ॉल्यूशन पर इमेजिंग करने में सक्षम होते हैं। हालांकि, पतले वर्गों को काटते समय ब्लेड से भ्रूण कोशिकाओं पर लागू यांत्रिक बल और विरूपण साइटोनेम को नष्ट कर देता है। मोटे वर्ग ऊतक के भीतर बरकरार एक्सटेंशन को संरक्षित करते हुए अनुभाग के भीतर गहराई के एक बड़े क्षेत्र की अनुमति देते हैं। इसके अतिरिक्त, मोटे वर्गों का उपयोग ऊतक वर्गों के अत्यधिक तह या बकलिंग को रोकने के लिए हैंडलिंग में आसानी की अनुमति देता है।
इस प्रोटोकॉल ई 8-10.5 माउस भ्रूण के ऊतक में साइटोनेम्स के अधिकतम संरक्षण के लिए अनुकूलित किया गया था। सेक्शनिंग के बाद ऊतक के न्यूनतम हेरफेर ने साइटोनेम्स के लगातार बेहतर समग्र संरक्षण में सुधार किया। यह संभावना है कि आकार और ऊतक जटिलता में वृद्धि के कारण बाद के विकास चरणों और वयस्क ऊतक वर्गों के लिए तकनीक को अनुकूलित करने के लिए आगे अनुकूलन की आवश्यकता होगी। इसके बाद इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होने के बाद सेक्शनिंग की आवश्यकता होगी। इस तरह के ऊतकों को साइटोनेम जैसे एक्सटेंशन को संरक्षित करने के लिए सेक्शनिंग के दौरान अतिरिक्त समाशोधन चरणों और ऊतक हैंडलिंग के अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। इन अतिरिक्त चरणों पर विचार करने और इस प्रोटोकॉल के भविष्य के अनुप्रयोगों के लिए संबोधित करने की आवश्यकता होगी।
The authors have nothing to disclose.
सेंट जूड चिल्ड्रन रिसर्च हॉस्पिटल में सेल और आणविक जीवविज्ञान इमेजिंग कोर द्वारा बनाए गए माइक्रोस्कोप का उपयोग करके छवियों का अधिग्रहण किया गया था। माउस उपभेदों को जैक्स से प्राप्त किया गया था। इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ ग्रांट आर 35 जीएम 122546 (एसकेओ) और सेंट जूड चिल्ड्रन रिसर्च हॉस्पिटल के एएलएसएसी द्वारा समर्थित किया गया था।
12-well plate; Nunc Cell-Culture Treated | Thermo Scientific | 150628 (Fisher Scientific 12-565-321) | |
24-Well Plate, Round Nunc | Thermo Fisher Scientific | 142475 | |
60 mm dish | Corning, Falcon | 353004 (Fisher Scientific 08772F) | |
Absorbant towels (Professional Kimtech Science Kimwipes) | Kimberly-Clark KIMTECH | 34155 (Fisher Scientific 06666A) | |
Actin Red 555 ReadyProbes Reagent | Invitrogen | R37112 | |
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H+L) | Jackson Immunoresearch Lab Inc | 703-546-155 | 1:1,000 working concentration |
Bead Bath 6L 230V | Lab Armor | Item #12L048 (Mfr. Model #74220-706) | set to 55 °C |
chicken anti-GFP | Aves Labs | SKU GFP-1020 | 1:250 working concentration |
CO2 chamber | plexiglass chamber connected to a CO2 emitting line. | ||
Confocal laser-scanning microscope | Leica Microsystems | model: Leica TCS SP8 | |
DAPI Solution (1 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
Dissecting scissors (Vannas Scissors) | World Precision Instruments | 14003 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11960044 | |
Eppendorf Research Plus single channel pipette, 0.1-2.5 µL | Eppendorf | 3123000012 | |
Eppendorf Research Plus single channel pipette, 0.5-10 µL | Eppendorf | 3123000020 | |
Eppendorf Research Plus single channel pipette, 100-1,000 µL | Eppendorf | 3123000063 | |
Eppendorf Research Plus single channel pipette, 20-200 µL | Eppendorf | 3123000055 | |
Feather Disposable Scalpel #10 | Fisher Scientific | Catalog No.NC9999403 | |
Fetal Bovine Serum, certified, United States | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 16000044 | |
Fisherbrand Fine Point High Precision Forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
Fisherbrand Labeling Tape | Fisher Scientific | 15-954 | |
Formaldehyde, 16%, methanol free, Ultra Pure EM Grade | Polysciences | 18814-10 | |
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 14025 | |
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pap Pen | Vector laboratories | H-4000 | |
Leica Application Suite X (LAS X) with LIGHTNING | Leica Microsystems | Microscope software | |
L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 25030081 | |
Low Melting Point Agarose- UltraPure | Invitrogen | 16520 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11140050 | |
Moria MC 17 BIS Perforated Spoon | Fine Science Tools | 1037018 | |
Mounting media (ProLong Diamond Antifade Mountant) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | P36961 | |
Mouse: B6.129X1(Cg)-Shhtm6Amc/J (ShhGFP/+) | The Jackson Laboratory | Strain #:008466 | |
Mouse: B6.Cg-Shhtm1(EGFP/cre)Cjt/J (Shh-Cre) | The Jackson Laboratory | Strain #:005622 | |
Mouse: C57BL/6J (B6) | The Jackson Laboratory | Strain #:000664 | |
Mouse: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J (Rosa26 mTmG) | The Jackson Laboratory | Strain #:007576 | |
Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 (Fisher Scientific NC9660079) | |
PBS + Ca2+ + Mg2+ | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 14040133 | |
Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
SHARP Precision Barrier Tips, Extra Long for P-10 and Eppendorf 10 µL | Denville Scientific | P1096-FR | |
SHARP Precision Barrier Tips, For P-1000 and Eppendorf 1,000, 1,250 µL | Denville Scientific | P1126 | |
SHARP Precision Barrier Tips, For P-20 and Eppendorf 20 µL | Denville Scientific | P1121 | |
SHARP Precision Barrier Tips, For P-200 and Eppendorf 200 µL | Denville Scientific | P1122 | |
Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
Sodium Pyruvate (100 mM) (100x) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11360070 | |
Super Glue | Gorilla | ||
SuperFrost Plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
TPP centrifuge tubes, volume 15 mL, polypropylene | TPP Techno Plastic Products | 91015 | |
TPP centrifuge tubes, volume 50 mL, polypropylene | TPP Techno Plastic Products | 91050 | |
Transfer pipette, polyethylene | Millipore Sigma | Z135003 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
Vari-Mix Platform Rocker | Thermo Fisher Scientific | 09-047-113Q | set to 20 RPM |
Vibratome | Leica Biosytems | VT1000 S |