Her er en optimalisert trinnvis protokoll gitt for fiksering, immunoppnåelse og seksjonering av embryoer for å oppdage spesialiserte signalering filopodia kalt cytoner i utviklingen av musevev.
Utviklingsvevsmønster og postdevelopmental vev homeostase avhenger av kontrollert levering av cellulære signaler kalt morfogener. Morfogener virker på en konsentrasjons- og tidsavhengig måte for å spesifisere distinkte transkripsjonsprogrammer som instruerer og forsterker celle skjebnen. En mekanisme som passende morfogensignaleringster terskler sikres er gjennom levering av signalproteiner ved spesialisert filopodia kalt cytoner. Cytonemes er veldig tynne (≤200 nm i diameter) og kan vokse til lengder på flere hundre mikron, noe som gjør deres bevaring for fastbildeanalyse utfordrende. Dette dokumentet beskriver en raffinert metode for delikat håndtering av museembryoer for fiksering, immunstaining og tykk seksjonering for å muliggjøre visualisering av cytoner ved hjelp av standard konfokal mikroskopi. Denne protokollen har blitt brukt til å visualisere cytonemer som kobler distinkte cellulære signalrom under utvikling av muse nevralrør. Teknikken kan også tilpasses for å oppdage cytoner på tvers av vevstyper for å lette avhør av utviklingssignalering ved enestående oppløsning.
Embryonal utvikling er orkestrert gjennom koordinert aktivering av morfogen signalveier. Morfogener er små, utskilte proteiner som er kategorisert i Sonic Hedgehog (SHH), transformerer vekstfaktor β (TGF-β)/bone morphogenic protein (BMP), Wingless-related integration site (WNT), og fibroblast og epidermal vekstfaktor (FGF / EGF) familier. Morfogenes produseres og frigjøres fra cellulære organiseringssentre under vevsutvikling og etablerer signalgradienter på tvers av organiseringsfelt av celler for å informere vevsmorfogenese 1,2,3,4,5. En representasjon av morfogen gradienter finnes i det utviklende nervesystemet, hvor det presumptive sentralnervesystemet er mønstret gjennom morfogenveisaktivering. Dette vevet, referert til som nevralrøret, består av motsatte gradienter av SHH utskilt av ventral-mest notokord og gulvplate, og WNTs / BMPs utskilt fra dorsal takplate, for å mønster distinkt nevrale forfedre region6. Nevralrøret brukes ofte til å forhøre morfogen gradient integritet i utviklingsforskning.
Morfogen gradient formasjon er avhengig av tett regulering av signaldispersjon7. En cellulær mekanisme som dette skjer ved er gjennom dannelsen av lange signalfilopodia kalt cytoner som letter direkte levering av morfogener fra signalproduserende celler til spesifikke målcellepopulasjoner. Cytonemer har blitt observert for å utvide hundrevis av mikrometer for å deponere morfiner på signalmottakende cellemembraner 8,9. Forstyrrelse av cytoneme-mediert morfogentransport fører til utviklingsavvik hos både fluer og vertebrater, og fremhever deres betydning under vevsmønster 10,11,12,13,14.
Til dags dato har cytoner blitt dokumentert i Drosophila, kylling og sebrafiskmodeller, men avbildning av strukturene i utvikling av pattedyrembryoer er fortsatt utfordrende 8,9,15. Et hinder for effektivt å avbilde cytoner i komplekse pattedyrvev in situ er deres tynne og skjøre natur, noe som gjør dem utsatt for skade ved konvensjonelle fikseringsmetoder8. Vi hadde tidligere utviklet og optimalisert protokoller for en modifisert elektronmikroskopifiksativ (MEM-fix) for å bevare cytoner i dyrkede celler og muliggjøre studien deres ved hjelp av konfokal mikroskopi16,17.
Bruk av MEM-fix-teknikken har tillatt identifisering av noen av molekylene som er involvert i SHH-indusert cytonemedannelse og funksjon 11,16,17. Imidlertid nødvendiggjorde bekreftelse av disse funnene i den fysiologisk relevante konteksten av nevral rørmønster utviklingen av nye teknikker for å fikse og bildemus embryonalt vev. En protokoll for å fikse museembryoer på en måte som opprettholder cytoneme integritet og tillater immunstaining og etterfølgende seksjonering av embryonalt vev for konfokal analyse er skissert her. Denne protokollen ble utviklet ved hjelp av et membran-bundet grønt fluorescerende protein (GFP) for å merke membranforlengelser fra SHH-produserende celler i det utviklende nevrale røret. Implementering av denne protokollen vil ta opp ubesvarte spørsmål knyttet til utbredelsen og betydningen av cytoner i utviklingen av pattedyrsystemer.
Denne protokollen ble utviklet for bevaring av delikate cytoner i embryonale vevsseksjoner for høyoppløselig fluorescensmikroskopi. Til dags dato har visualisering av cytoner i vev på tvers av ulike modellorganismer i stor grad stolt på ektopisk uttrykk for fluorescerende merkede proteiner ved hjelp av levende vevsavbildning. Dessverre bidrar bruken av fluorescerende merket levende bildebehandling sjelden til analyse av endogene uttrykte proteiner, kan introdusere tidsbegrensninger og krever spesialiserte bildestadier og mikroskoper. Fargings- og seksjoneringsmetoden som er beskrevet her, bevarer cytoner og andre cellulære utvidelser for å tillate immunhiistokjemi for eventuell påvisning av endogenede uttrykte proteiner. Denne teknologien vil legge til rette for ny innsikt i hvordan morfiner transporteres over forskjellige vev in vivo og utvider omfanget av modellsystemer der cytoner kan studeres.
Denne protokollen bruker helmontert farging og vibratom tykk-seksjonering, som unngår bruk av likevektsløsning som glyserol eller kryorotektant løsninger som sukrose. Det tar sikte på å minimere seksjonert vevshåndtering for å muliggjøre maksimal bevaring av cellulære utvidelser. Redusert håndtering av vevet etter seksjonering ga konsekvent bedre resultater i den totale bevaringen av cytoner. Dermed er seksjonering av embryoet et av de siste trinnene før avbildning.
MEM-fix, en fikseringsteknikk utviklet for bevaring av cytoner av dyrkede celler, består av en kombinasjon av glutaraldehyd og PFA som muliggjør forbedret 3D-bevaring av den medfødte cellearkitekturen som kan sammenlignes med deres levende dimensjoner16,17. Dessverre var MEM-fix ikke nyttig for embryofiksering fordi glutaraldehyd kan auto-fluoresce og sterkt begrenser antistoffinntrengning og epitopbinding i celler på grunn av høy protein krysskoblingsaktivitet22,23. Dermed ble seksjoneringsprotokoller etter PFA-fikseringsforhold optimalisert for å tillate bevaring av cellulære utvidelser i embryonalt vev. Selv om PFA kan bevare cytoneme-lignende utvidelser i embryonalt vev, bør bildeanalyse utføres med forsiktighet. PFA kan forårsake delvis dehydrering av individuelle celler og vev, noe som fører til mindre volumreduksjon og dannelse av små ekstracellulære rom i det faste vevet.
Denne protokollen unngår de ekstra trinnene for sukrose resaturation for kryoprotection og vev clearing fordi sukrose eller glyserol løsninger kan forårsake en mindre resaturation avvevet 24. Den resulterende mindre hevelsen kan ødelegge faste cellulære utvidelser og cytonemer som migrerer mellom celler og over vev. Dette var tydelig når man sammenlignet tykk-seksjonert vibratom med cryostat seksjoner. Selv om økende vevstykkelse forbedret bevaringen av intakte cytoner, hadde de sukrose-resettede kryostatseksjonene konsekvent en lavere forekomst av påvisbare cytoner.
Optimalisering av denne protokollen avslørte at 100 μm tykke seksjoner var de beste for å sikre bevaring av intakte cytoner. Tynnere seksjoner brukes vanligvis til avbildning fordi de fleste konfokale mikroskoper bare er i stand til å avbilde med tilstrekkelig oppløsning for å visualisere cellulære utvidelser til en dybde på ~ 20-40 μm uten å fjernemerket 25. Imidlertid ødelegger de mekaniske kreftene og forvrengningen som brukes på embryonale celler fra bladet mens du kutter tynne seksjoner, cytoner. Tykkere seksjoner gir mulighet for et større dybdeområde i seksjonen samtidig som intakte forlengelser i vevet bevares. I tillegg gir bruk av tykkere seksjoner enkel håndtering for å forhindre overdreven folding eller spenne av vevsdelene.
Denne protokollen ble optimalisert for maksimal bevaring av cytoner i vev av E8-10,5 museembryoer. Minimal manipulering av vevet etter seksjonering ga konsekvent forbedret generell bevaring av cytoner. Det er sannsynlig at ytterligere optimalisering vil være nødvendig for å tilpasse teknikken for senere utviklingsstadier og voksne vevsseksjoner på grunn av økt størrelse og vevskompleksitet. Dette vil kreve seksjonering etterfulgt av immunfluorescensfarging. Slike vev kan kreve ytterligere ryddetrinn og tilpasning av vevshåndtering under seksjonering for å bevare cytoneme-lignende utvidelser. Disse tilleggstrinnene må vurderes og behandles for fremtidige programmer i denne protokollen.
The authors have nothing to disclose.
Bilder ble anskaffet ved hjelp av mikroskoper vedlikeholdt av Cell and Molecular Biology Imaging Core ved St. Jude Children’s Research Hospital. Musestammer ble oppnådd fra JAX. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health grant R35GM122546 (SKO) og av ALSAC ved St. Jude Children’s Research Hospital.
12-well plate; Nunc Cell-Culture Treated | Thermo Scientific | 150628 (Fisher Scientific 12-565-321) | |
24-Well Plate, Round Nunc | Thermo Fisher Scientific | 142475 | |
60 mm dish | Corning, Falcon | 353004 (Fisher Scientific 08772F) | |
Absorbant towels (Professional Kimtech Science Kimwipes) | Kimberly-Clark KIMTECH | 34155 (Fisher Scientific 06666A) | |
Actin Red 555 ReadyProbes Reagent | Invitrogen | R37112 | |
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H+L) | Jackson Immunoresearch Lab Inc | 703-546-155 | 1:1,000 working concentration |
Bead Bath 6L 230V | Lab Armor | Item #12L048 (Mfr. Model #74220-706) | set to 55 °C |
chicken anti-GFP | Aves Labs | SKU GFP-1020 | 1:250 working concentration |
CO2 chamber | plexiglass chamber connected to a CO2 emitting line. | ||
Confocal laser-scanning microscope | Leica Microsystems | model: Leica TCS SP8 | |
DAPI Solution (1 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
Dissecting scissors (Vannas Scissors) | World Precision Instruments | 14003 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11960044 | |
Eppendorf Research Plus single channel pipette, 0.1-2.5 µL | Eppendorf | 3123000012 | |
Eppendorf Research Plus single channel pipette, 0.5-10 µL | Eppendorf | 3123000020 | |
Eppendorf Research Plus single channel pipette, 100-1,000 µL | Eppendorf | 3123000063 | |
Eppendorf Research Plus single channel pipette, 20-200 µL | Eppendorf | 3123000055 | |
Feather Disposable Scalpel #10 | Fisher Scientific | Catalog No.NC9999403 | |
Fetal Bovine Serum, certified, United States | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 16000044 | |
Fisherbrand Fine Point High Precision Forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
Fisherbrand Labeling Tape | Fisher Scientific | 15-954 | |
Formaldehyde, 16%, methanol free, Ultra Pure EM Grade | Polysciences | 18814-10 | |
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 14025 | |
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pap Pen | Vector laboratories | H-4000 | |
Leica Application Suite X (LAS X) with LIGHTNING | Leica Microsystems | Microscope software | |
L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 25030081 | |
Low Melting Point Agarose- UltraPure | Invitrogen | 16520 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11140050 | |
Moria MC 17 BIS Perforated Spoon | Fine Science Tools | 1037018 | |
Mounting media (ProLong Diamond Antifade Mountant) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | P36961 | |
Mouse: B6.129X1(Cg)-Shhtm6Amc/J (ShhGFP/+) | The Jackson Laboratory | Strain #:008466 | |
Mouse: B6.Cg-Shhtm1(EGFP/cre)Cjt/J (Shh-Cre) | The Jackson Laboratory | Strain #:005622 | |
Mouse: C57BL/6J (B6) | The Jackson Laboratory | Strain #:000664 | |
Mouse: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J (Rosa26 mTmG) | The Jackson Laboratory | Strain #:007576 | |
Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 (Fisher Scientific NC9660079) | |
PBS + Ca2+ + Mg2+ | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 14040133 | |
Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
SHARP Precision Barrier Tips, Extra Long for P-10 and Eppendorf 10 µL | Denville Scientific | P1096-FR | |
SHARP Precision Barrier Tips, For P-1000 and Eppendorf 1,000, 1,250 µL | Denville Scientific | P1126 | |
SHARP Precision Barrier Tips, For P-20 and Eppendorf 20 µL | Denville Scientific | P1121 | |
SHARP Precision Barrier Tips, For P-200 and Eppendorf 200 µL | Denville Scientific | P1122 | |
Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
Sodium Pyruvate (100 mM) (100x) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11360070 | |
Super Glue | Gorilla | ||
SuperFrost Plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
TPP centrifuge tubes, volume 15 mL, polypropylene | TPP Techno Plastic Products | 91015 | |
TPP centrifuge tubes, volume 50 mL, polypropylene | TPP Techno Plastic Products | 91050 | |
Transfer pipette, polyethylene | Millipore Sigma | Z135003 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
Vari-Mix Platform Rocker | Thermo Fisher Scientific | 09-047-113Q | set to 20 RPM |
Vibratome | Leica Biosytems | VT1000 S |