Denne protokol beskriver etableringen af enteroider, en tredimensionel tarmmodel, fra føtal tarmvæv. Immunofluorescerende billeddannelse af epitelbiomarkører blev brugt til modelkarakterisering. Apikal eksponering af lipopolysaccharider, et bakterielt endotoksin, ved hjælp af mikroinjektionsteknik induceret epitelpermeabilitet på en dosisafhængig måde målt ved lækage af fluorescerende dextran.
Humane fostervævsafledte enteroider fremstår som en lovende in vitro-model til undersøgelse af tarmskader hos for tidligt fødte spædbørn. Enteroider udviser polaritet, der består af et lumen med en apikal kant, stramme kryds og et basolateralt ydre lag udsat for vækstmedier. Konsekvenserne af tarmskader omfatter slimhindebetændelse og øget permeabilitet. Testning af tarmpermeabilitet hos sårbare for tidligt fødte forsøgspersoner er ofte ikke mulig. Således er en in vitro føtal vævsafledt tarmmodel nødvendig for at studere tarmskader hos for tidligt fødte spædbørn. Enteroider kan bruges til at teste ændringer i epitelpermeabilitet reguleret af tætte krydsproteiner. I enteroider differentierer tarmstamceller sig til alle epitelcelletyper og danner en tredimensionel struktur på en kældermembranmatrix udskilt af musesarkomceller. I denne artikel beskriver vi de metoder, der anvendes til at etablere enteroider fra føtalt tarmvæv, karakterisere de enteroidtætte krydsproteiner med immunfluorescerende billeddannelse og teste epitelpermeabilitet. Da gramnegativ dominerende bakteriel dysbiose er en kendt risikofaktor for tarmskade, brugte vi lipopolysaccharid (LPS), et endotoksin produceret af gramnegative bakterier, til at inducere permeabilitet i enteroiderne. Fluorescein-mærket dextran blev mikroinjiceret i enteroid lumen, og serielle dextrankoncentrationer lækket ind i kulturmediet blev målt for at kvantificere ændringerne i paracellulær permeabilitet. Eksperimentet viste, at apikal eksponering for LPS inducerer epitelpermeabilitet på en koncentrationsafhængig måde. Disse resultater understøtter hypotesen om, at gram-negativ dominerende dysbiose bidrager til mekanismen for tarmskade hos for tidligt fødte spædbørn.
For tidligt fødte spædbørn udsættes for hyppig og langvarig betændelse, der sætter dem i øget risiko for tarmskader, der resulterer i langvarig invaliditet eller død1. Forskningen på området er udfordret af den begrænsede evne til at udføre forsøg på sårbare for tidligt fødte børn. Desuden har mangel på egnede modeller hæmmet den omfattende undersøgelse af det for tidlige tarmmiljø2. Eksisterende in vitro– og in vivo-modeller har ikke i tilstrækkelig grad repræsenteret det for tidlige menneskelige tarmmiljø. Specifikt kan enkeltepitelføtale cellelinjer muligvis ikke danne stramme kryds, og dyremodeller udviser forskellige inflammatoriske og immunologiske reaktioner end menneskelige for tidligt fødte spædbørn. Med opdagelsen af Wnt-signalering som en primær vej i spredning og differentiering af tarmkryptstamceller og de nye Lgr5+ vævsstamceller blev tarmvævsafledte organoider såsom enteroider og kolonoider etableret som in vitro-modeller 3,4,5. Ved hjælp af denne teknologi er det muligt at oprette og udnytte tredimensionelle (3D) enteroidmodeller, der er udviklet fra hele væv eller biopsi af en tarm for at studere epitelresponser på tarmmiljøet 6,7.
I modsætning til typiske tarmcellelinjer dyrket i kultur udviser enteroider polaritet med et lumen forbundet med tætte krydsproteiner8. Dette giver mulighed for eksponering for den basolaterale grænse i vækstmedierne samt luminal mikroinjektion for at vurdere den apikale grænse. Endvidere viser enteroider lignende genetiske, fysiologiske og immunologiske egenskaber som det humane epitel 9,10. Fostervævsafledte enteroider giver mulighed for undersøgelse af præmaturitetens rolle på epitelfunktionen. De unikke egenskaber ved enteroider kan ligne det for tidlige tarmmiljø nærmere9. Vævsafledte enteroider kan bruges til at teste for tæt krydsintegritet som en monolagsform eller som 3D-strukturer indlejret i en størknet kældermembranproteinblanding. En mikroinjektionsteknik er nødvendig for sidstnævnte form, hvis der ønskes en apikal eksponering. Måling af epitelresponser i enteroidmodeller inkluderer genekspression ved RNA-sekventering, biomarkører ved enzymbundet immunoassay (ELISA) eller avancerede billeddannelsesteknikker. Den teknik, der præsenteres her, giver en anden mulig mulighed for at måle bruttopermeabilitet med fluorometri.
Tarmskade hos for tidligt fødte spædbørn har en multifaktoriel patogenese, der omfatter ubalancen i tarmmikrobielle samfund. Enteroider kan give fremragende modeller til at studere visse aspekter af for tidlige tarmsygdomme, såsom nekrotiserende enterocolitis, der involverer epitelfunktioner11. Enteroider viser lignende egenskaber som den menneskelige føtal tarm10. Udsættelse af enteroider for lipopolysaccharid (LPS), et endotoksin produceret af gramnegative bakterier, i kulturmediet, da en basolateral eksponering inducerer genekspression, der kan føre til øget inflammation og tarmpermeabilitet7. Denne undersøgelse har til formål at evaluere ændringerne i bruttoepitelpermeabilitet efter apikal eksponering for bakterielle produkter såsom LPS. Resultaterne kan give indsigt i de mikrobe-epitelinteraktioner, der er involveret i patogenesen af tarmskade. Metoden designet til at teste bruttopermeabilitet kræver mikroinjektionsopsætning og dygtighed.
Denne protokol beskriver etableringen af enteroider fra føtal tarmvæv samt modelkarakterisering med immunfluorescerende farvning og epitelpermeabilitetstest. Enteroidernes permeabilitet blev testet ved hjælp af en mikroinjektionsteknik og serielle tidsbanemålinger af lækket dextran-FITC-koncentration i kulturmediet. Det nye ved denne protokol er den apikale eksponering, der mere ligner menneskets tarmfysiologi sammenlignet med basolateral eksponering i kulturmedierne7. I tidligere undersøgelser anvendte Hill et al. seriel billeddannelse og beregning af fluorescensintensiteten over tid16. Ares et al. udsatte den basolaterale membran i en epitelmodel for LPS og sammenlignede derefter det cellulære genekspressionsmønster7. Til sammenligning bruger vi apikal eksponering af de testede reagenser og undersøger derefter potentielle ændringer i bruttopermeabilitet ved at måle serielle koncentrationer af lækket dextran i kulturmedierne. Vores metode giver også mulighed for seriel sammenlignende analyse af cytokiner produceret af epitelceller i kulturmedier og genekspression ved at indsamle cellulært mRNA. LPS har været almindeligt anvendt til at studere tarmskader i dyre- og in vitro-modeller på grund af dets evne til at inducere permeabilitet og betændelse 7,17. Da LPS blev testet i denne model, blev epitelpermeabilitet differentieret efter eksponeringskoncentration. Denne protokol kan udvides til at studere andre sygdomspatologier ved hjælp af forskellige mikroinjicerede materialer og resultatmålinger.
Kritiske trin i denne protokol omfatter etablering af enteroider fra føtal tarmvæv, enteroid karakterisering og mikroinjektionsteknikken. Integriteten af denne undersøgelse afhænger af nøjagtig celleprøvetagning. Brug af anatomiske landemærker og blodkar er nyttigt for at sikre udvælgelsen af små tarmceller. På grund af den robuste vækst og differentiering af fostrets tarmstamceller er en omfattende procedure til isolering af stamcellerne fra andre epitelceller ikke nødvendig. Efter at enteroiderne er etableret, er det vigtigt at bekræfte modellens egenskaber ved farvning for proteiner og cellemarkører. I denne protokol blev enteroiderne farvet for enterocytter ved anvendelse af villin og CDX2, Paneth-celler ved hjælp af lysozym og bægerceller ved hjælp af mucin, alle de celler, der findes i tyndtarmsepitelet18,19,20. I modsætning til traditionelle enkeltcellelinjer, der viser en celletype, etablerer enteroider alle celletyper fra tarmstamcellerne8. Farvningsdelen af denne protokol kan ændres til de specifikke cellulære markører af interesse. Afgørende for pålideligheden af denne protokol er mikroinjektionsteknikken. Mikropipettespidsernes konsistens kan verificeres ved at måle volumen pr. pumpe ved hjælp af dextran-FITC-opløsning og visualisere diameteren af spidserne under mikroskopet. På grund af risikoen for kontaminering kan den samme mikropipette ikke bruges til mere end én eksponering. Derudover kan formen og væksten af enteroiderne påvirkes af indholdet af deres vækstmedier. Vi fandt ud af, at de sfæriske snarere end blomkålformede enteroider gav bedre modeller til mikroinjektion. Den sfæriske form kan induceres af en større Wnt-faktor i medierne21.
Denne protokol afhænger i vid udstrækning af udøverens evne til mikroinjektion for at reducere variationer, især i tidsfølsomme målinger. Variationer kan minimeres ved at have den samme erfarne performer med konsistente teknikker, bruge den samme celleoprindelse for at undgå genetisk variation, teste ved samme passage for at fjerne modenhedsbias og dyrke cellerne i samme type medie til lignende celledifferentiering. Vækstmediets komponenter kan fremkalde varierende differentiering af stamceller in vitro snarere end i et in vivo-miljø . For eksempel udtrykkes lysozym in vivo ikke før uge 22-24 af svangerskabsudvikling, når Paneth-celler dannes og bliver funktionelle22. Vi var imidlertid i stand til at opdage lysozym i vores enteroider etableret fra 10-ugers føtale tarme. Denne metode kan begrænse antallet af testede eksponeringer ad gangen på grund af den høje tekniske færdighed, der kræves til mikroinjektion. Dextranlækagen fra mikroinjektionspunktionshullet kan påvirke vurderingen af permeabilitet. For at eliminere denne effekt anbefales tredobbelt vask umiddelbart efter mikroinjektionen for at fjerne resterende dextran fra proceduren. Dextrankoncentrationen i mediet skal måles hver time i 4-6 timer efter mikroinjektion. Forsøg med en signifikant stigning i dextrankoncentrationen inden for 2-4 timer efter injektion bør udelukkes fra den endelige analyse.
Denne metode har flere fordele. Det kræver lavere omkostninger og færre ressourcer i forhold til enteroidafledte monolag på transwell. Derudover kan det udvides til andre eksponeringer såsom levende bakterier eller vira for at studere den indledende interaktion mellem tarmmikrober og epitelet. Enteroidens lukkede lumen kan opretholde en stabil vækst af mikroinjicerede levende bakterier uden forurening af vækstmediet13. I modsætning til monolaget, der udsættes for vækstmedier og inkubationsoxygen, er det lukkede lumen et stramt, isoleret rum. Et lukket lumen giver mulighed for ingen kommunikation til vækstmedierne og et luminalt iltindhold, der er lavere over tid med levende bakterievækst13.
Brugen af føtalt tarmvæv skildrer mere præcist tarmepitelet hos for tidligt fødte spædbørn sammenlignet med voksne tarmstamceller eller dyremodeller7. Endvidere tillader polariteten af enteroider både apikale og basolaterale eksponeringer og målinger23. Enteroiderne danner et lukket lumen med lavere iltningskoncentration, som nærmere efterligner tarmens iltkoncentration24. I modsætning til mere teknologisk avancerede protokoller16 giver brugen af bruttomediemålinger mulighed for større tilgængelighed af denne teknik. Eksperimentet viste, at epitellækage kan induceres ved apikal eksponering for LPS og er koncentrationsafhængig. Da denne metode undersøger ændringerne i lækket koncentration af dextran, er den nyttig til at detektere grove funktionelle ændringer i tætte kryds. Messenger RNA-indsamling og sekventering af de eksponerede enteroider og western blot-analyse kan supplere analysen af de grove funktionelle ændringer. Denne model studerer tarmepitelintegritet i et system, der meget ligner det for tidlige miljø og dermed kan bruges til at få en bedre forståelse af for tidlige tarmskader og andre sygdomspatologier.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Ian Glass og personalet ved Birth Defects Research Laboratory ved University of Washington for at dele fostervævet. Vi takker også Dr. Michael Dame og Dr. Jason Spence ved Translational Tissue Modeling Laboratory ved University of Michigan for deres endeløse støtte og vejledning gennem hele processen.
Amphotericin 250 uL/mL | Gibco | 15-290-026 | |
Anti-CDX-2 [CDX2-88] 0.5mL concentrated Mouse, IgG, monoclonal | Biogenex | MU392A-5UC | |
Anti-Claudin 2 antibody (ab53032) | abcam | ab53032 | |
Anti-Claudin 3 antibody (ab15102) | abcam | ab15102 | |
Anti-LYZ antibody produced in rabbit | Millipore Sigma | HPA066182-100UL | |
Anti-Mucin 2/MUC2 Antibody (F-2): sc-515032 | Santa Cruz | sc-515032 | |
Anti-Villin, Clone VIL1/4107R 0.5mL concentrated Rabbit, IgG, monoclonal | Biogenex | NUA42-5UC | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Millipore Sigma | A8806 | |
Cell culture plates, CytoOne 12-well non-treated plates | USA Scientific Inc | 50-754-1395 | |
Cell culture plates, CytoOne 6-well non-treated plates | USA Scientific Inc | 50-754-1560 | |
Centrifuge with 15 mL tube buckets | Eppendorf | 05-413-110 | |
CHIR 99021 | Tocris Bioscience | 4423 | |
Confocal microscope | Olympus FV1200 | N/A | Or a similar microscope |
Conical centrifuge tubes, 15 ml | Falcon | 05-527-90 | |
Cover glass for microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-DP | |
Disposable scalpels | Mopec | 22-444-272 | |
Dmidino-2-phenylindole (DAPI) Solution (1 mg/mL) | Fisher Scientific | 62248 | |
Dulbecco's Phosphate-buffered Saline (DPBS, 1X) | Fisher Scientific | AAJ67802K2 | |
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid tetrasodium salt (EGTA) | Millipore Sigma | E8145-10G | |
Fluorescein isothiocyanate dextran (Dextran-FITC) 4 kDa | Millipore Sigma | 46944 | |
Fuorescence microplate reader | Agilent BioTek | Synergy HTX | |
Gentamicin 50 mg/mL | Gibco | 15-750-060 | |
Glass capillary tubes, single-barrel borosilicate, 1×0.5mm, 6" (cut in half before pulling) | A-M systems | 626500 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 594 | Fisher Scientific | A32742 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Fisher Scientific | A32731 | |
Goat Serum | Fisher Scientific | 16210064 | |
ImageJ software | NIH | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | Stem Cell Technologies | 06010 | |
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 | Millipore Sigma | L4391-1MG | |
Magnetic stand | World Precision Instruments | M10 | |
Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL | Corning | 354234 | protein concentration > 9 mg/mL preferably |
Micro forceps | Fisher Scientific | 13-820-078 | |
Micro scissors | Fisher Scientific | 08-953-1B | |
Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
Micropipette puller | World Precision Instruments | SU-P1000 | Or a similar equipment |
Microscope slides | Fisher Scientific | 22-034486 | |
Occludin Polyclonal Antibody | Fisher Scientific | 71-1500 | |
Paraformaldehyde 32% aqueous solution | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | RT 15714 | |
Petri Dishes, 35×10 mm | Fisher Scientific | 150318 | |
Petri Dishes, 60×15 mm | Fisher Scientific | 12-565-94 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | 10010031 | |
PicoPump foot switch | World Precision Instruments | 3260 | |
Pipette tips, non-filtered, 1000 uL | Fisher Scientific | 21-402-47 | |
Pipette tips, non-filtered, 20 uL | Fisher Scientific | 21-402-41 | |
Pipette tips, non-filtered, 200 uL | Fisher Scientific | 21-236-54 | |
Pneumatic PicoPump system | World Precision Instruments | SYS-PV820 | or a similar picopump system |
Primocin 50 mg/mL, 10×1 ml vial | InvivoGen | ant-pm-1 | |
Steel base plate | World Precision Instruments | 5052 | |
Stereo microscope | Zeiss stemi 350 | Or a similar microscope | |
ThermoSafe PolarPack Foam Bricks | Sonoco | 03-531-53 | |
Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
Wall air supply | N/A | N/A | |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris Bioscience | 1254 | |
ZO-1 Polyclonal Antibody | Fisher Scientific | 61-7300 |