Detta protokoll beskriver upprättandet av enteroider, en tredimensionell tarmmodell, från fostrets tarmvävnad. Immunofluorescerande avbildning av epitelbiomarkörer användes för modellkarakterisering. Apikal exponering av lipopolysackarider, ett bakteriellt endotoxin, med hjälp av mikroinjektionsteknik inducerad epitelpermeabilitet på ett dosberoende sätt mätt genom läckage av fluorescerande dextran.
Mänskliga fostervävnadsderiverade enteroider växer fram som en lovande in vitro-modell för att studera tarmskador hos för tidigt födda barn. Enteroider uppvisar polaritet, bestående av en lumen med en apikal kant, täta korsningar och ett basolateralt yttre skikt utsatt för tillväxtmedia. Konsekvenserna av tarmskador inkluderar slemhinneinflammation och ökad permeabilitet. Att testa tarmpermeabilitet hos sårbara prematura människor är ofta inte genomförbart. Således behövs en in vitro-fostervävnadsbaserad tarmmodell för att studera tarmskador hos för tidigt födda barn. Enteroider kan användas för att testa förändringar i epitelpermeabilitet som regleras av täta korsningsproteiner. I enteroider differentieras tarmstamceller i alla epitelcelltyper och bildar en tredimensionell struktur på en källarmembranmatris som utsöndras av mussarkomceller. I den här artikeln beskriver vi de metoder som används för att etablera enteroider från fostrets tarmvävnad, karakterisera de enteroida täta korsningsproteinerna med immunofluorescerande avbildning och testa epitelpermeabilitet. Eftersom gramnegativ dominerande bakteriell dysbios är en känd riskfaktor för tarmskada använde vi lipopolysackarid (LPS), ett endotoxin som produceras av gramnegativa bakterier, för att inducera permeabilitet i enteroiderna. Fluoresceinmärkt dextran mikroinjicerades i enteroidlumen, och seriella dextrankoncentrationer som läckte ut i odlingsmediet mättes för att kvantifiera förändringarna i paracellulär permeabilitet. Experimentet visade att apikal exponering för LPS inducerar epitelpermeabilitet på ett koncentrationsberoende sätt. Dessa fynd stöder hypotesen att gramnegativ dominerande dysbios bidrar till mekanismen för tarmskada hos för tidigt födda barn.
För tidigt födda barn utsätts för frekvent och långvarig inflammation som ger dem en ökad risk för tarmskada som resulterar i långvarig funktionsnedsättning eller död1. Forskningen inom detta område utmanas av den begränsade förmågan att utföra experiment på sårbara för tidigt födda barn. Dessutom har bristen på lämpliga modeller hindrat den omfattande studien av den för tidiga tarmmiljön2. Befintliga in vitro– och in vivo-modeller har misslyckats med att på ett heltäckande sätt representera den för tidiga mänskliga tarmmiljön. Specifikt kan enstaka epiteliala fostercellinjer inte bilda täta korsningar, och djurmodeller uppvisar olika inflammatoriska och immunologiska svar än mänskliga för tidigt födda barn. Med upptäckten av Wnt-signalering som en primär väg i spridningen och differentieringen av tarmkryptostamceller och de nya Lgr5+ vävnadsstamcellerna etablerades tarmvävnadsderiverade organoider såsom enteroider och koloider som in vitro-modeller 3,4,5. Med hjälp av denna teknik är det möjligt att skapa och använda tredimensionella (3D) enteroidmodeller som utvecklas från hela vävnaden eller biopsi i en tarm för att studera epitelsvar på tarmmiljön 6,7.
I motsats till typiska tarmcellinjer som odlas i odling uppvisar enteroider polaritet med en lumen förbunden med täta korsningsproteiner8. Detta möjliggör exponering för den basolaterala gränsen i tillväxtmediet, liksom luminal mikroinjektion för att bedöma den apikala gränsen. Vidare uppvisar enteroider liknande genetiska, fysiologiska och immunologiska egenskaper som det humana epitelet 9,10. Fostervävnad-härledda enteroider möjliggör undersökning av prematuritetens roll på epitelfunktionen. De unika egenskaperna hos enteroider kan likna den prematura tarmmiljön närmare9. Vävnadsderiverade enteroider kan användas för att testa för tät korsningsintegritet som en monolagerform eller som 3D-strukturer inbäddade i en stelnad källarmembranproteinblandning. En mikroinjektionsteknik krävs för den senare formen om en apikal exponering önskas. Mätningen av epitelsvar i enteroidmodeller inkluderar genuttryck genom RNA-sekvensering, biomarkörer med enzymbunden immunanalys (ELISA) eller avancerade avbildningstekniker. Tekniken som presenteras här ger ett annat genomförbart alternativ för att mäta grov permeabilitet med fluorometri.
Tarmskada hos för tidigt födda barn har en multifaktoriell patogenes som inkluderar obalansen i tarmmikrobiella samhället. Enteroider kan ge utmärkta modeller för att studera vissa aspekter av prematura tarmsjukdomar som nekrotiserande enterokolit som involverar epitelfunktioner11. Enteroider uppvisar liknande egenskaper som den mänskliga fostertarmen10. Att utsätta enteroider för lipopolysackarid (LPS), ett endotoxin som produceras av gramnegativa bakterier, i odlingsmediet som en basolateral exponering inducerar genuttryck som kan leda till ökad inflammation och tarmpermeabilitet7. Denna studie syftar till att utvärdera förändringarna i grov epitelpermeabilitet efter apikal exponering för bakterieprodukter som LPS. Resultaten kan ge insikt i de mikrob-epitelinteraktioner som är involverade i patogenesen av tarmskada. Metoden som är utformad för att testa grov permeabilitet kräver mikroinjektionsinställning och skicklighet.
Detta protokoll beskriver upprättandet av enteroider från fostrets tarmvävnad, samt modellkarakterisering med immunofluorescerande färgning och epitelial permeabilitetstestning. Enteroidernas permeabilitet testades med hjälp av en mikroinjektionsteknik och seriella tidsförloppsmätningar av läckt dextran-FITC-koncentration i odlingsmediet. Nyheten i detta protokoll är den apikala exponeringen som mer liknar människans tarmfysiologi jämfört med basolateral exponering i odlingsmediet7. i tidigare studier använde Hill et al. seriell avbildning och beräkning av fluorescensintensiteten över tid16. exponerade det basolaterala membranet i en epitelmodell för LPS och jämförde sedan det cellulära genuttrycksmönstret7. I jämförelse använder vi apikal exponering av de testade reagenserna och undersöker sedan potentiella förändringar i grov permeabilitet genom att mäta seriella koncentrationer av läckt dextran i odlingsmediet. Vår metod möjliggör också seriell jämförande analys av cytokiner som produceras av epitelceller i odlingsmedier och genuttryck genom att samla cellulärt mRNA. LPS har ofta använts för att studera tarmskada hos djur- och in vitro-modeller på grund av dess förmåga att inducera permeabilitet och inflammation 7,17. När LPS testades i denna modell differentierades epitelpermeabiliteten genom exponeringskoncentration. Detta protokoll kan utvidgas för att studera andra sjukdomspatologier med hjälp av olika mikroinjicerade material och resultatmätningar.
Kritiska steg i detta protokoll inkluderar etablering av enteroider från fostrets tarmvävnader, enteroid karakterisering och mikroinjektionstekniken. Integriteten hos denna studie beror på korrekt cellprovtagning. Att använda anatomiska landmärken och blodkärl är till hjälp för att säkerställa valet av tunntarmsceller. På grund av den robusta tillväxten och differentieringen av fostrets tarmstamceller är ett omfattande förfarande för att isolera stamcellerna från andra epitelceller inte nödvändigt. Efter att enteroiderna har fastställts är det viktigt att bekräfta modellens egenskaper genom färgning för proteiner och cellmarkörer. I detta protokoll färgades enteroiderna för enterocyter med villin och CDX2, Paneth-celler med lysozym och bägare celler med mucin, alla celler som finns i tunntarmsepitelet18,19,20. Till skillnad från traditionella enskilda cellinjer som visar en celltyp, etablerar enteroider alla celltyper från tarmstamcellerna8. Färgningsdelen av detta protokoll kan modifieras för de specifika cellulära markörerna av intresse. Avgörande för tillförlitligheten i detta protokoll är mikroinjektionstekniken. Konsistensen hos mikropipettspetsarna kan verifieras genom att mäta volymen per pump med dextran-FITC-lösning och visualisera spetsarnas diameter under mikroskopet. På grund av risken för kontaminering kan samma mikropipett inte användas för mer än en exponering. Dessutom kan enteroidernas form och tillväxt påverkas av innehållet i deras tillväxtmedier. Vi fann att de sfäriska snarare än blomkålformade enteroiderna gav bättre modeller för mikroinjektion. Den sfäriska formen kan induceras av en större Wnt-faktor i mediet21.
Detta protokoll beror till stor del på artistens skicklighet i mikroinjektion för att minska variationer, särskilt i tidskänsliga mätningar. Variationer kan minimeras genom att ha samma erfarna artist med konsekventa tekniker, använda samma cellursprung för att undvika genetisk variation, testa vid samma passage för att ta bort mognadsbias och odla cellerna i samma typ av media för liknande celldifferentiering. Komponenterna i tillväxtmediet kan inducera varierande differentiering av stamceller in vitro snarare än i en in vivo-miljö . Till exempel, in vivo, uttrycks lysozym inte förrän vecka 22-24 av graviditetsutveckling när Paneth-celler bildas och blir funktionella22. Vi kunde dock upptäcka lysozym i våra enteroider etablerade från 10-veckors fostertarmar. Denna metod kan begränsa antalet testade exponeringar samtidigt på grund av den höga tekniska skicklighet som krävs för mikroinjektion. Dextranläckaget från mikroinjektionspunktionshålet kan påverka bedömningen av permeabilitet. För att eliminera denna effekt rekommenderas trippeltvättar omedelbart efter mikroinjektionen för att avlägsna kvarvarande dextran från proceduren. Dextrankoncentrationen i mediet bör mätas varje timme i 4-6 timmar efter mikroinjektion. Experiment med en signifikant ökning av dextrankoncentrationen inom 2-4 timmar efter injektion bör uteslutas från den slutliga analysen.
Denna metod har flera fördelar. Det kräver en lägre kostnad och färre resurser jämfört med enteroid-härledda monolager på transwell. Dessutom kan det utvidgas till andra exponeringar som levande bakterier eller virus för att studera den initiala interaktionen mellan tarmmikrober och epitelet. Enteroidens slutna lumen kan upprätthålla en stabil tillväxt av mikroinjicerade levande bakterier utan kontaminering av tillväxtmediet13. Till skillnad från monolagret som utsätts för tillväxtmedia och inkubationssyre är det slutna lumen ett tätt, isolerat utrymme. En sluten lumen möjliggör ingen kommunikation till tillväxtmediet och en luminal syrehalt som är lägre över tid med levande bakterietillväxt13.
Användningen av fostrets tarmvävnad visar mer exakt tarmepitelet hos för tidigt födda barn jämfört med vuxna tarmstamceller eller djurmodeller7. Vidare möjliggör polariteten hos enteroider både apikala och basolaterala exponeringar och mätningar23. Enteroiderna bildar en sluten lumen med lägre syresättningskoncentration, som närmare efterliknar tarmarnas syresättningskoncentration24. Till skillnad från mer tekniskt avancerade protokoll16 möjliggör användningen av bruttomediemätningar större tillgänglighet för denna teknik. Experimentet visade att epitelläckage kan induceras av apikal exponering för LPS och är koncentrationsberoende. Eftersom denna metod undersöker förändringarna i läckt koncentration av dextran är den användbar för att upptäcka grova funktionella förändringar i snäva korsningar. Messenger RNA-insamling och sekvensering av de exponerade enteroiderna och western blot-analys kan komplettera analysen av de grova funktionella förändringarna. Denna modell studerar tarmepitelintegritet i ett system som mycket liknar den prematura miljön och därmed kan användas för att få en bättre förståelse för prematura tarmskador och andra sjukdomspatologier.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Dr. Ian Glass och personalen vid Birth Defects Research Laboratory vid University of Washington för att dela fostervävnaderna. Vi tackar också Dr. Michael Dame och Dr. Jason Spence vid Translational Tissue Modeling Laboratory vid University of Michigan för deras oändliga stöd och vägledning under hela processen.
Amphotericin 250 uL/mL | Gibco | 15-290-026 | |
Anti-CDX-2 [CDX2-88] 0.5mL concentrated Mouse, IgG, monoclonal | Biogenex | MU392A-5UC | |
Anti-Claudin 2 antibody (ab53032) | abcam | ab53032 | |
Anti-Claudin 3 antibody (ab15102) | abcam | ab15102 | |
Anti-LYZ antibody produced in rabbit | Millipore Sigma | HPA066182-100UL | |
Anti-Mucin 2/MUC2 Antibody (F-2): sc-515032 | Santa Cruz | sc-515032 | |
Anti-Villin, Clone VIL1/4107R 0.5mL concentrated Rabbit, IgG, monoclonal | Biogenex | NUA42-5UC | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Millipore Sigma | A8806 | |
Cell culture plates, CytoOne 12-well non-treated plates | USA Scientific Inc | 50-754-1395 | |
Cell culture plates, CytoOne 6-well non-treated plates | USA Scientific Inc | 50-754-1560 | |
Centrifuge with 15 mL tube buckets | Eppendorf | 05-413-110 | |
CHIR 99021 | Tocris Bioscience | 4423 | |
Confocal microscope | Olympus FV1200 | N/A | Or a similar microscope |
Conical centrifuge tubes, 15 ml | Falcon | 05-527-90 | |
Cover glass for microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-DP | |
Disposable scalpels | Mopec | 22-444-272 | |
Dmidino-2-phenylindole (DAPI) Solution (1 mg/mL) | Fisher Scientific | 62248 | |
Dulbecco's Phosphate-buffered Saline (DPBS, 1X) | Fisher Scientific | AAJ67802K2 | |
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid tetrasodium salt (EGTA) | Millipore Sigma | E8145-10G | |
Fluorescein isothiocyanate dextran (Dextran-FITC) 4 kDa | Millipore Sigma | 46944 | |
Fuorescence microplate reader | Agilent BioTek | Synergy HTX | |
Gentamicin 50 mg/mL | Gibco | 15-750-060 | |
Glass capillary tubes, single-barrel borosilicate, 1×0.5mm, 6" (cut in half before pulling) | A-M systems | 626500 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 594 | Fisher Scientific | A32742 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Fisher Scientific | A32731 | |
Goat Serum | Fisher Scientific | 16210064 | |
ImageJ software | NIH | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | Stem Cell Technologies | 06010 | |
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 | Millipore Sigma | L4391-1MG | |
Magnetic stand | World Precision Instruments | M10 | |
Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL | Corning | 354234 | protein concentration > 9 mg/mL preferably |
Micro forceps | Fisher Scientific | 13-820-078 | |
Micro scissors | Fisher Scientific | 08-953-1B | |
Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
Micropipette puller | World Precision Instruments | SU-P1000 | Or a similar equipment |
Microscope slides | Fisher Scientific | 22-034486 | |
Occludin Polyclonal Antibody | Fisher Scientific | 71-1500 | |
Paraformaldehyde 32% aqueous solution | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | RT 15714 | |
Petri Dishes, 35×10 mm | Fisher Scientific | 150318 | |
Petri Dishes, 60×15 mm | Fisher Scientific | 12-565-94 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | 10010031 | |
PicoPump foot switch | World Precision Instruments | 3260 | |
Pipette tips, non-filtered, 1000 uL | Fisher Scientific | 21-402-47 | |
Pipette tips, non-filtered, 20 uL | Fisher Scientific | 21-402-41 | |
Pipette tips, non-filtered, 200 uL | Fisher Scientific | 21-236-54 | |
Pneumatic PicoPump system | World Precision Instruments | SYS-PV820 | or a similar picopump system |
Primocin 50 mg/mL, 10×1 ml vial | InvivoGen | ant-pm-1 | |
Steel base plate | World Precision Instruments | 5052 | |
Stereo microscope | Zeiss stemi 350 | Or a similar microscope | |
ThermoSafe PolarPack Foam Bricks | Sonoco | 03-531-53 | |
Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
Wall air supply | N/A | N/A | |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris Bioscience | 1254 | |
ZO-1 Polyclonal Antibody | Fisher Scientific | 61-7300 |