Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Utveckling av knock-out muskelcellinjer med Lentivirusmedierad CRISPR / Cas9-genredigering

Published: June 16, 2022 doi: 10.3791/64114
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1, 1
1University Grenoble Alpes, INSERM, U1216, CHU Grenoble Alpes, Grenoble Institut Neurosciences, 2Genome Center, University of California, Davis

Summary

Protokollet beskriver hur man genererar knock-out myoblaster med CRISPR / Cas9, från utformningen av guide-RNA till cellulär kloning och karakterisering av knock-out-klonerna.

Abstract

En viktig tillämpning av clustered regulatory interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas 9 är utvecklingen av knock-out cellinjer, specifikt för att studera funktionen hos nya gener/proteiner associerade med en sjukdom, identifierade under den genetiska diagnosen. För utvecklingen av sådana cellinjer måste två huvudfrågor lösas upp: införande av CRISPR-verktygen (Cas9 och guide-RNA) med hög effektivitet i de valda cellerna och begränsning av Cas9-aktiviteten till den specifika raderingen av den valda genen. Protokollet som beskrivs här är dedikerat till införandet av CRISPR-verktygen i svårtransfekterade celler, såsom muskelceller. Detta protokoll är baserat på användningen av lentivirus, framställda med plasmider allmänt tillgängliga, för vilka alla kloningssteg beskrivs för att rikta in sig på en gen av intresse. Kontrollen av Cas9-aktivitet har utförts med hjälp av en anpassning av ett tidigare beskrivet system som kallas KamiCas9, där transduktionen av cellerna med ett lentivirus som kodar för ett guide-RNA riktat mot Cas9 möjliggör gradvis avskaffande av Cas9-uttryck. Detta protokoll har tillämpats på utvecklingen av en RYR1-knock out human muskelcelllinje, som har karakteriserats ytterligare på protein- och funktionsnivå, för att bekräfta knockouten av denna viktiga kalciumkanal som är involverad i muskel intracellulär kalciumfrisättning och i excitation-kontraktionskoppling. Förfarandet som beskrivs här kan enkelt tillämpas på andra gener i muskelceller eller i andra svårtransfekterade celler och producera värdefulla verktyg för att studera dessa gener i mänskliga celler.

Introduction

Med utvecklingen av gensekvensering och identifiering av mutationer i gener med okända funktioner i en specifik vävnad utgör utvecklingen av relevanta cellulära modeller för att förstå funktionen hos en ny målgen och bekräfta dess engagemang i de relaterade patofysiologiska mekanismerna ett viktigt verktyg. Dessutom är dessa modeller av stor betydelse för den framtida terapeutiska utvecklingen 1,2 och utgör ett intressant alternativ till utvecklingen av knock-out djurmodeller i rak linje med de internationella rekommendationerna för minskad användning av djur i försök. Genredigering med CRISPR/Cas9 är bland de mest kraftfulla verktygen som för närvarande finns tillgängliga, vilket har möjliggjort utvecklingen av många knock-out/knock-in-modeller, och riktad genvalidering med CRISPR/Cas9 är bland de mest använda applikationerna av CRISPR/Cas93. Framgången för genredigering är beroende av förmågan att introducera CRISPR-verktygen (guiden RNA och nukleas cas9) i målcellsmodellen, vilket kan vara en utmaning i många svårtransfekterade celler, såsom muskelceller4. Denna utmaning kan övervinnas med användning av virus, vanligtvis lentivirus, som har den stora fördelen att effektivt transducera många celltyper och leverera sin transgen. Men dess största nackdel är integrationen av transgenen i värdcellgenomet, vilket leder till potentiell förändring av gener lokaliserade på integrationsstället och till det permanenta uttrycket av transgenen, vilket i fallet med nukleas cas9 skulle resultera i skadliga konsekvenser5. En smart lösning har föreslagits av Merienne ochkollegorna 6, som består av introduktion i cellerna av ett guide-RNA riktat mot själva Cas9-genen, vilket leder till Cas9-inaktivering. En anpassning av denna strategi presenteras här som ett användarvänligt och mångsidigt protokoll som gör det möjligt att slå ut praktiskt taget vilken gen som helst i svårtransfekterade celler.

Målet med protokollet som presenteras här är att inducera inaktiveringen av en gen av intresse för odödliga muskelceller. Det kan användas för att slå ut alla gener av intresse, i olika typer av odödliga celler. Protokollet som beskrivs här innehåller steg för att designa guiden RNA och deras kloning till lentivirala plasmider, för att producera CRISPR-verktygen i lentivirala vektorer, för att transducera cellerna med de olika lentivirusen och för att klona cellerna för att producera en homogen redigerad cellinje.

Med hjälp av detta protokoll har odödliga mänskliga skelettmuskelceller utvecklats med radering av typ 1 ryanodinreceptorn (RyR1), en viktig kalciumkanal som är involverad i intracellulär kalciumfrisättning och muskelkontraktion7. Knock-out (KO) av genen har bekräftats på proteinnivå med western blot och på funktionsnivå med kalciumavbildning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Muskelbiopsier erhölls från Bank of Tissues for Research (Myobank, en partner i EU-nätverket EuroBioBank, Paris, Frankrike) i enlighet med europeiska rekommendationer och fransk lagstiftning. Skriftligt informerat samtycke erhölls från alla individer. Odödliga myoblaster producerades vänligt av Dr. V. Mouly (Myology Institute, Paris, Frankrike), och protokollen godkändes av Myology Institute etikkommitté (MESRI, n AC-2019-3502).

1. CRISPR-guide design

  1. Identifiera regionen för genen som ska raderas. Sök efter dess genomiska sekvens med hjälp av genomwebbläsarverktyg som ensembl.org eller genome.ucsc.edu och bestäm de kromosomiska koordinaterna för de två regionerna för att leta efter guide-RNA (gRNA), på båda sidor av regionen som ska raderas.
    1. För genen som används här, erhålla FASTA-sekvensen för RYR1-genen och sekvensen för exon 101 enligt följande. I ensembl, sök RYR1 i den senaste versionen av det mänskliga genomet, välj den första posten och klicka på transkriptet av proteinkodningssekvensen. Klicka sedan på Exons för att omdirigera till listan över exoner av genen.
    2. Klicka på Ladda ner sekvens och välj Endast genomisk sekvens för att ladda ner hela konsensussekvensen för hela genen. Bläddra ner i listan över genens exoner och introner och välj den eller de riktade.
    3. Hitta motsvarande nukleotidsekvens i genen. Välj nukleotidsekvenserna för intronerna omedelbart uppströms och nedströms exonen som ska raderas, som kommer att användas för att söka efter gRNA.
  2. Designa de två gRNA, som kallas guide 1 och guide 2 här, i de regioner som identifieras i steg 1.1 (introner uppströms och nedströms regionen som ska raderas) med hjälp av onlineverktyg som Crispor.tefor.net8. Välj de två gRNA åtskilda av några hundra baspar (bp), sekvensen för varje gRNA är exakt 20 nukleotider lång utan protospacer intilliggande motiv (PAM). Välj de bästa guiderna som finns tillgängliga för att begränsa off-target. Se bild 1 för ett exempel på guidedesign.
    1. Sekvensen mellan de två guiderna förväntas raderas och resultera i knock-out av genen av intresse, och därmed välja positionen för de två guiderna så att den tar bort en väsentlig sekvens eller en väsentlig exon i genen av intresse. Se till att den borttagna sekvensen/exonen inte finns uteslutande i ett alternativt transkript av genen och/eller att den kodar för en viktig del av proteinet, så att dess radering kommer att resultera i en funktionell knock-out.
      OBS: Även om Cas9-klyvningsstället förutspås inträffa 3 bp uppströms protospacer intilliggande motiv (PAM), kan klyvning på ett större avstånd också inträffa, så en bra lösning är att inte bero på den exakta lokaliseringen av klyvningsstället, såsom klyvning i intron.
  3. Bestäm den omvända komplementsekvensen (RC) för varje gRNA, utan PAM, för att få följande sekvenser: Guide 1 och Guide 1-RC, Guide 2 och Guide 2-RC.
  4. Beställ primers som presenteras i tabell 1 för att utföra kloning av plasmiderna. Under hela protokollet, använd primers i en koncentration av 10 nM i sterilH2O.
    OBS: Sekvenserna som läggs till gRNA i dessa primers (fetstilta och understrukna) motsvarar sekvensen för plasmiden före och efter guiden, promotor respektive transaktiverande Crispr-RNA (tracrRNA) och bör inte modifieras för att säkerställa en god överlappning mellan primers och plasmid.

2. Plasmidkloning

OBS: I detta steg kommer gRNA att införas i plasmidens ryggrad för lentivirusproduktion. En kassett som kodar för de två gRNA produceras först genom successiva polymeraskedjereaktioner (PCR), med användning av de överlappande primersna. Den nya kassetten sätts sedan in i den lentivirala ryggradsplasmiden #87919.

  1. Erhålla följande plasmider: plasmid #87919, kodning för CRISPR-guide-RNA i en lentiviral vektor och plasmid #87904-kodning för SpCas9-sekvensen i en lentivirral vektor.
  2. Kassett konstruktion
    OBS: Kloningsprotokollet sammanfattas i Figur 2.
    1. Kör en PCR (A) reaktion med 2 μl plasmid #87919, 2 μl primer_XmaIF, 2 μl primer_Guide1R, 25 μl polymerasblandning och 19 μlH2O. Kör följande PCR-program (program 1): initial denaturering 5 min vid 98 °C, följt av 30 cykler av: 30 s vid 98 °C, 30 s vid 60 °C, 1 min 45 s vid 72 °C och en slutlig töjning på 7 min vid 72 °C. Tm för de primers som beskrivs i steg 1.4 är 60 °C.
      OBS: Även om töjningstiden i program 1 verkar ganska lång, har denna förlängningstid valts för att säkerställa produktion av tillräckligt med material av rätt storlek. På grund av de upprepade sekvenserna i plasmiden (sekvensen av tracrRNA efter RNA-guider upprepas tre gånger i plasmiden #87919) är PCR-förstärkningen av det förväntade DNA: t svårt, och ytterligare mindre band produceras i de successiva PCR: erna. På grund av konkurrensen mellan de olika PCR-produkterna har antingen töjningstiden ökats (för att gynna den längsta och för att ha tillräckligt med renat material i slutet), eller så har en touch down PCR (program 2) använts för det långa fragmentet (som beskrivs för PCR (final) i steg 2.2.6).
    2. Separera PCR-produkterna på en 1% agarosgel i Tris-Borate-EDTA-buffert (TBE), skär ut och rena 300 bp-fragmentet. Utför rening med hjälp av en särskild sats enligt tillverkarens anvisningar, med eluering i en slutlig volym på 20 μL. Använd antingen det renade fragmentet direkt eller förvara vid -20 °C för steg 2.2.5.
    3. Kör en PCR (B) reaktion, med 2 μL plasmid #87919, 2 μL primer_Guide1F, 2 μL primer_Guide2R, 25 μL polymerasblandning och 19 μLH2Omed PCR-programmet 1. Separera PCR-produkterna på en 1% agarosgel i TBE, skär ut och rena 400 bp-fragmentet i 20 μl elueringsbuffert. Använd antingen det renade fragmentet direkt eller förvara vid -20 °C för steg 2.2.5.
    4. Kör en PCR (C) reaktion, med 2 μL plasmid #87919, 2 μL primer_Guide2F, 2 μL primer_BlpIR, 25 μL polymerasblandning och 19 μLH2Omed PCR-program 1. Separera PCR-produkterna på en 1% agarosgel i TBE-buffert. Skär ut och rena 600 bp-fragmentet i 20 μl elueringsbuffert. Använd antingen det renade fragmentet direkt eller förvara vid -20 °C för steg 2.2.6.
      OBS: Ett annat fragment vid 900 bp kan vara synligt på grund av hybridisering av primern på de upprepade regionerna i plasmiden, enligt beskrivningen i ANMÄRKNINGen till steg 2.2.1. Om det finns, bör detta band kasseras.
    5. Kör en PCR (D) reaktion, med 2 μL eluering PCR A (från steg 2.2.2), 2 μL eluering PCR B (från steg 2.2.3), 2 μL primer_XmaIF, 2 μL primer_Guide2R, 25 μL polymerasblandning och 19 μLH2O, med PCR-program 1. Separera PCR-produkterna på en 1% agarosgel i TBE-buffert; skära ut och rena 700 bp-fragmentet i 20 μl elueringsbuffert. Använd antingen det renade fragmentet direkt eller förvara vid -20 °C för steg 2.2.6.
      OBS: Andra band kan vara synliga vid >1 000 bp, 400 bp och 300 bp, på grund av hybridisering av primers på de upprepade regionerna och bör kasseras.
    6. Kör en PCR-reaktion (slutlig) med 4 μl eluerings-PCR C (från steg 2.2.4), 4 μl eluerings-PCR D (från steg 2.2.5), 4 μl primer_XmaIF, 4 μl primer_BlpIR, 50 μl polymerasblandning och 34 μlH2O. Programmet som används är följande (PCR-program 2): initial denaturering i 5 min vid 98 °C; sex cykler på: 30 s vid 98 °C, 30 s vid 66 °C (minskning av hybridiseringstemperaturen med 1 °C per cykel), 1 min 45 vid 72 °C; 35 cykler på: 30 s vid 98 °C, 30 s vid 60 °C, 1 min 45 vid 72 °C och en slutlig töjning på 5 min vid 72 °C.
      OBS: PCR-programmet för denna slutliga förstärkning är en touch down PCR, som skiljer sig från den föregående, på grund av den stora storleken på den slutliga förstärkningen som innehåller två upprepade tracrRNA-sekvenser strax efter varje guide.
    7. Separera PCR-produkterna på en 1% agarosgel i TBE-buffert; skära ut och rena den slutliga kassetten, som migrerar vid cirka 1 300 bp i 20 μL elueringsbuffert. Kvantifiera den eluerade produkten. Använd antingen det renade fragmentet direkt eller förvara vid -20 °C för steg 2.3.2.1. Detta är den slutliga produkten som kommer att införas i den lentivirala plasmiden.
      OBS: Andra fragment kan vara synliga vid >1000 bp, 400 bp och 300 bp, vilket motsvarar ofullständiga PCR-fragment som bör kasseras.
  3. Insättning av gRNA-kassetten i den lentivirala plasmidstommen.
    1. Linjärisera plasmiden genom dubbel uppslutning av plasmiden #87919 med restriktionsenzymerna XmaI och BlpI.
      1. Bered reaktionen med 15 μl rekommenderad buffert, 15 μl plasmid (1μg/μl), 7,5 μl BlpI-enzym (vid 10 U/μl), 7,5 μl XmaI-enzym (vid 10 U/μl) och 112,5 μlH2O. Inkubera i 1 timme vid 37 °C och därefter i 20 minuter vid 65 °C. Ladda den totala mängden på en 1% agarosgel, skär ut och rena ~ 10 kb plasmiden med ett lämpligt kit. Eluering utförs i 20 μL buffert och den eluerade produkten kvantifieras med optisk densitetsmätning.
        OBS: Använd ett lämpligt reningsprotokoll för stora DNA-fragment, såsom protokollet som beskrivs av Sun och coll9.
    2. Ligate gRNA-kassetten och plasmiden. Förbered reaktionsblandningen med gRNA-kassett från steg 2.2.7 och den linjäriserade plasmiden från steg 2.3.1.1, tillsätt 2 μL enzym ochH2Oför att få en slutlig volym på 10 μL. Inkubera i 15 minuter vid 50 °C för att producera den slutliga plasmiden som kallas p_guides.
      OBS: DNA-kassettmängden bör vara mellan 50-100 ng och plasmidmängden mellan 100-200 ng, med ett molförhållande på 2: 1.
  4. Använd 2 μl av den nyberedda plasmiden för att omvandla kemiskt kompetent E.Coli såsom Stbl3 (50 μL) eller XL10-Gold och sprid på LB-agarplatta med 100 μg/ml ampicillin efter 1 timmes tillväxt vid 37 °C utan antibiotika. Inkubera vid 37 °C över natten. Välj några kolonier och utför en miniförberedelse med ett kommersiellt kit enligt tillverkarens instruktioner.
  5. Utför en PCR-förstärkning på miniprep-DNA med Primer_XmaI och Primer_BlpR med PCR-program 1 (se figur 2). Separera PCR-produkterna på en 1% agarosgel i TBE-buffert. Välj några kolonier (~ 5) med ett band med den förväntade storleken på cirka 1300 bp.
  6. Utför DNA-sekvensering av de valda kolonierna med hjälp av Primer_XmaI eller Primer_BlpR för att bekräfta korrekt införande av gRNA-kassetten.
    OBS: En av de sekvensverifierade kolonierna används vidare i studien, och plasmiden kallas p_guides.
  7. Upprepa från steg 2.2 (kassettkonstruktion) med Primers-Killer F och R, och Primers-mCherry F och R. Använd en sekvensverifierad koloni för vidare analys. Plasmiden kallas p_Killer.

3. Lentivirus produktion

  1. Producera och rena en stor mängd av alla nödvändiga plasmider med hjälp av ett endotoxinfritt maxi-prep-kit enligt tillverkarens instruktioner. Bered alikvoter vid 2 μg/μl. Förvaras vid -20 °C
  2. Beredning av celler (dag 1)
    1. Bered 18 plattor med 145 cm fröade med 1 x 106 HEK293-celler per platta i 16 ml medium bestående av Dulbeccos modifierade örnmedium (DMEM) hög glukospyruvat, kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin / streptomycin. Förstärk cellerna vid 37 °C i en 5% CO2-inkubator i 3 dagar.
      OBS: Produktion av lentivirus måste utföras med försiktighet i ett biosäkerhetsnivå 2-laboratorium med hjälp av anpassade skyddsutrustningar, inklusive engångsskyddsdräkt, skyddskåpa och handskar. Alla experiment måste göras under en laminär flödeshuv (BSLII säkerhetsskåp) med filterspetsar. All lösning som innehåller lentivirus och allt använt plast-/glasavfall måste inaktiveras med etanol 70% eller annan virusinaktivator.
  3. Transfektion av celler (dag 4)
    1. Kontrollera cellernas sammanflöde för att vara säker på att de har nått 60% -65% sammanflöde.
    2. Förbered transfektionslösningen som för varje platta innehåller: 20,8 μg av den plasmid som av intresse (p-guider, eller p-Killer, eller pCas9 #87904), 4,8 μg av plasmiden som kodar för kuvertet (VSV-G, #8454), 20,8 μg av plasmiden psPAX2 (#12260) för lentivirral förpackning, 136 μL kalciumfosfat och justera medH2Otill en slutlig volym på 1 000 μL. Tillsätt denna lösning droppvis och under agitation till 1 ml 2x HEPES-buffrad saltlösning (HBS).
      OBS: Förbered inte en blandning för alla plattor samtidigt för att säkerställa en optimal beredning av reagens; förbered en blandning för sex plattor samtidigt, t.ex. för 18 plattor, förbered tre gånger en blandning för sex plattor.
    3. Inkubera vid rumstemperatur (RT) i minst 10 min och tillsätt 2 ml lösning droppvis till cellerna. Homogenisera transfektionsreagenset med försiktig omrörning av plattan bakåt, framåt, upp och ner, inkubera vid 37 °C, 5 %CO2 i minst 5 timmar.
      OBS: Från denna punkt och fram till slutet av produktionen av lentivirus, använd ytterligare skyddsutrustning, inklusive ett andra par handskar, skyddshylsor och en engångsplastron.
    4. Fem timmar efter transfektionen, ta bort mediet från plattorna och skölj med PBS för att bli av med transfektionsreagens. Tillsätt 12 ml färskt medium och inkubera 48 timmar vid 37 °C, 5 %CO2.
  4. Insamling av viruspartiklarna (dag 6)
    1. Samla och poola mediet från alla plattor. Centrifugera vid 800 x g i 5 min vid 4 °C för att pelletera cellulärt skräp. Filtrera supernatanten med ett 0,45 μm filter (flera filter krävs).
    2. Centrifugera vid 68 300 x g i 2 timmar vid 4 °C i en svängande skoprotor. Ta bort supernatanten och låt rören upp och ner under säkerhetsskåpet på ett papper i 5-10 minuter för att ta bort så mycket vätska som möjligt och tillsätt sedan 100 μL HEK-spridningsmedium per pellet. Efter minst 2 timmar vid 4 °C, återsuspendera pelletsen genom pipettering upp och ner. Slå samman alla återsuspenderade pellets.
      OBS: Pellets kan lämnas i mediet över natten vid 4 °C före alikvotering.
    3. Alikvot lentivirus i provstorlek på 10 μl eller 25 μl (beroende på användning) och snäppfrysning med flytande kväve. Förvaras vid -80 °C. Frys inte en alikvot som har tinats.
  5. Upprepa steg 3.2 till 3.4 med andra plasmider av intresse för att producera LV-guider, LV-Killer och LV-Cas9.
    OBS: Som ett alternativ kan lentivirusen köpas från ett företag eller en virusanläggning.

4. Titrering av Lentivirus

OBS: Virustitreringen utförs på HEK293-celler. Titreringen är viktig för att i de efterföljande stegen införliva ett exakt antal lentivirus per cell (oavsett sats av lentivirus), för cellerna av intresse. Antalet viruspartiklar som effektivt omvandlar en cell kallas multiplicitet av infektion (MOI): MOI 10 motsvarar således införandet av 10 virala partiklar per cell. Eftersom frysnings-/upptiningscykeln påverkar lentivirusets livskraft utförs titreringen med en fryst lentivirus alikvot, och varje efterföljande experiment kommer att utföras med en ny alikvot av samma pool. En titreringsmetod beskrivs här, men andra metoder kan användas.

  1. Dag 1, frö 1 x 105 celler per platta i fem 35 mm plattor med glasöverdrag på botten och två 35 mm plattor utan täckglas.
  2. På dag 2, från de två plattorna utan täckglas, samla och räkna antalet celler efter trypsinisering och bestäm den genomsnittliga mängden celler per platta (N).
  3. Bered 100 μl lentivirus utspätt vid 1/10 i proliferationsmedium. Transducera de fem odlade plattorna med olika volymer av utspätt virus, från 1 till 50 μl utspätt virus. För detta protokoll, använd följande volymer för att transducera de fem plattorna: 1 μL, 5 μL, 10 μL, 20 μL, 50 μL. Inkubera i 48 timmar vid 37 °C, i en 5%CO2.
  4. På dag 4, fixa cellerna genom inkubation av täckglasen vid RT i 20 till 30 min i 4% paraformaldehyd. För LV-Cas9, permeabilisera cellerna med 0,1% Triton X100 i fosfatbuffertsaltlösning (PBS) i 10 minuter vid RT, mätta i PBS-0,1% Triton X100-2% Getserum- 0,5% Bovint serumalbumin (BSA) i 20 minuter vid RT och märk i 45 minuter vid RT med primär antikropp anti-V5 (utspädning 1/400) följt av 30 min inkubation vid RT med fluorescerande sekundär antikropp. Märk kärnorna med Hoescht (10 μg/ml i PBS) i 10 minuter vid RT.
  5. Montera täckglasögonen på en bild och observera med hjälp av ett fluorescerande mikroskop utrustat med ett 20x mål. För LV-guider och LV-Killer, efter fixering fortsätt direkt till kärnorna och montera täckglasen. För varje täckglas, räkna det totala antalet kärnor (totalt antal celler) i synfältet och antalet celler märkta (antingen med V5 eller mCherry) och bestäm förhållandet mellan celler märkta för varje täckglas.
  6. Välj ett täckglas där förhållandet mellan transducerade celler är minst 10% och inte överstiger 50%. Bestäm transduktionseffektiviteten (X) för denna täckglas och notera volymen av utspätt virus (V, i μL) som används för att erhålla denna transduktionseffektivitet.
    Equation 1
  7. Bestäm virusets titer (i infektiösa partiklar, representerade som ip / ml) enligt följande formel:
    Equation 2
    Utspädningsfaktorn är den utspädning av lentiviruset som utfördes i steg 4.3. Vi erhöll rutinmässigt en sluttiter på 1 x 109 ip/ml för LV-Cas9 och 1 x 1010 ip/ml för LV-guide, bestämd i HEK-celler.

5. Myoblast transduktion

OBS: De odödliga myoblasterna transduceras successivt med de tre lentivirus som tidigare producerats. De bibehålls vid en densitet under 50% i ett spridningsmedium som består av Hams F10 kompletterat med 20% FBS, 2% penicillin / streptomycin, 2% Ultroser G och odlas vid 37 ° C, 5% CO2.

  1. Bestäm volymen av lentivirus som behövs för att behandla det valda antalet celler med MOI 10 för LV-Cas9 och LV-guider och MOI 20 för LV-mördare, enligt följande formel:
    Equation 3
    OBS: I ett parallellt experiment har transduktionseffektiviteten jämförts på myoblaster och HEK, med hjälp av ett kontroll lentivirus (lenti-GFP), och vi har fastställt att fem gånger fler lentivirus behövs för att transducera en myoblast effektivt jämfört med en HEK-cell. Således motsvarar MOI 10 mätt på HEK två virala partiklar per myoblast. MOI som används här beräknas på HEK-celler.
  2. På dag 1, frö 96-brunnsplattor med 10 000 celler i 100 μl spridningsmedium per brunn. På dag 2, transducera cellerna under säkerhetsskåpet genom att lägga till lämplig volym LV-styrningar och LV-Cas9 beräknade i steg 5.1. Returnera cellerna till inkubatorn fram till dag 7.
    OBS: Användningen av MOI högre än 25, särskilt för LV-Cas9, kanske inte förbättrar antalet redigerade celler på grund av högre celldöd vid en hög koncentration av lentivirus.
  3. På dag 7, utför trypsinisering och räkna cellerna. Frö cellerna vid en sammanflöde av 40% till 50% i en ny platta och återför cellerna till inkubatorn. Fem timmar senare, transducera cellerna med LV-Killer vid en MOI på 20 (volym beräknad i steg 5.1). Förstärk cellerna i 5 till 10 dagar efter transfektion, i minst två passager, och håll dem alltid vid en låg sammanflöde på <50%. Cellerna är redo för nästa steg, cellulär kloning, när deras tillväxt återgår till det normala (uppskattat av delningstiden).
    OBS: Spridningen kan vara lite långsammare efter transduktionen. Den normala celltillväxten kan bestämmas före detta experimentella förfarande genom uppskattning av cellernas delningstid.

6. Cellulär kloning

OBS: Eftersom myoblasttransduktion är svår och aldrig når 100% effektivitet, även vid användning av lentivirus, krävs cellulär kloning för att få en fullständigt korrigerad cellinje. Detta är endast möjligt med odödliga celler, eller celler som kan odlas och förstärkas under några veckor / månader.

  1. Trypsinisera och räkna cellerna. Späd cellerna i proliferationsmedium vid 10 celler / ml och frö cellerna vid 1 cell / brunn i 96-brunnsplattor innehållande 100 μL / brunn medium.
    OBS: Antalet plattor som ska seedas beror på sannolikheten för den förväntade genredigeringen, 2 till 10 plattor används rutinmässigt.
  2. Övervaka cellerna för tillväxt och förstärk gradvis varje brunn i en större platta tills de når minst en 35 mm platta, samtidigt som myoblasternas sammanflöde hålls under 50%. Detta steg kan pågå i 2-6 veckor, beroende på vilka celler som används och deras förmåga att växa en gång isolerad i en brunn.

7. Klonval

OBS: Detta steg utförs för att identifiera vilken av de växande klonerna som har ändrats på lämpligt sätt.

  1. Designa en uppsättning primers som består av en primer som ligger före den första guiden (Primer_BeforeGuide1F) och en annan primer som ligger efter den andra guiden (Primer_AfterGuide2R) för att förstärka regionen som omsluter den förmodat modifierade sekvensen. Se tabell 1 för de primers som används här.
  2. Samla celler från varje klon, spara minst 300 000 celler för framtida förstärkning och extrahera genomiskt DNA med hjälp av något standardprotokoll på de återstående cellerna.
    1. Om ett stort antal kloner växer, för att kassera de icke-redigerade, utför ett snabbtest genom att slå samman celler från fem kloner i samma rör för att extrahera DNA från denna pool och testa med PCR. Upprepa med så många kloner som behövs. Separera sedan ytterligare poolerna som innehöll redigerade celler för att utföra individuell analys.
  3. Kontrollera redigeringen med PCR enligt följande. Förbered PCR-reaktionen med 1 μl Primer_BeforeGuide1F, 1 μl Primer_AfterGuide2R, 12,5 μl polymerasblandning, 3 μl genomiskt DNA och 7,5 μlH2O. Förstärk i en termocykling enligt tillverkarens instruktioner och primerparametrar. Kör på en 1% agarosgel för att identifiera de redigerade klonerna.
  4. Kontrollera redigeringen genom att sekvensera enligt följande. Utför Sanger-sekvensering av de valda klonerna för att bekräfta borttagningen och för att identifiera hur redigeringen har utförts i varje klon. Behåll mer än en redigerad klon för att se till att endast den riktade genen har modifierats och är ansvarig för den fysiologiska effekten som observerats och behåll en icke-redigerad klon som kommer att användas som en kontrollklon (CTRL) i de efterföljande experimenten.
  5. Expandera de markerade klonerna. När sammanflödet av varje klon har nått cirka 50%, trypsinisera cellerna och platta cellerna i en större skål tills tillräckligt med celler har producerats för att utföra de biokemiska och funktionella karakteriseringarna (vanligtvis mer än 1 x 106 per klon) och lagra frysta alikvoter av varje klon för framtida bruk.

8. Karakterisering av redigerade kloner

OBS: När några kloner har plockats och bekräftats genom DNA-sekvensering kan raderingen av den riktade genen bekräftas på proteinnivå med western blot och på funktionsnivå om en funktionell cellulär analys är tillgänglig för denna gen. När det gäller RYR1-KO, eftersom RyR1 är en kalciumkanal, har den funktionella karakteriseringen utförts med användning av kalciumavbildning på odlade celler.

  1. Proteinuttryck i redigerade kloner
    OBS: RyR1 uttrycks endast i differentierade myotubes10. Dess uttryck har utvärderats i myotubes med användning av Western blot, för att bekräfta raderingen vid proteinnivån av RyR1, liksom raderingen av Cas9-proteinet.
    1. Platta 200 000 celler i proliferationsmedium (beskrivet ovan, steg 5) på en yta av ca 1,76 cm2 i en 35 mm platta belagd med laminin (yta motsvarande en 200 μL droppe laminin vid 10 mg/ml i PBS med kalcium). När cellerna har fastnat på plattan efter att ha inkuberats i 2-3 timmar vid 37 ° C, 5%CO2, flytta odlingsmediet till ett differentieringsmedium bestående av DMEM låg glukos + 10% Hästserum + 1% penicillin / streptomycin och återför cellerna till inkubatorn i 6 dagar.
    2. Efter 6 dagars differentiering, samla in och lysera cellerna med 200 μL RIPA kompletterat med proteashämmare. Bestäm proteinkoncentrationen med Folin Lowry-metoden11.
    3. Ladda 15 μg protein, efter denaturering i 30 minuter vid RT i Laemmli denatureringsbuffert, på en 5% -15% gradient akrylamidgel. Efter elektroforetisk separation, överför proteinerna på Immobilon P vid 0,8 V i 4 h11.
    4. Efter mättnad av membranet i 30 minuter vid RT i PBS innehållande 0,1% Tween 20 och 5% Fettfri torrmjölk, inkubera membranet med de primära antikropparna utspädda i samma buffert i 2 timmar vid RT eller över natten vid 4 °C, tvätta membranet 5x i 5 min med PBS-0,1% Tween 20 och inkubera membranet med de sekundära antikropparna i 1 timme vid RT. De primära antikropparna som används är: antikroppar mot V5-tag (utspädning: 1/5000) för att detektera Cas9, anti-GAPDH (utspädning: 1/1000) som belastningskontroll, anti-RyR1-antikropp12,13 (utspädning: 1/10,000), antikropp mot alfa 1-underenheten i DHPR (utspädning: 1/1000) och antikropp mot myosintungkedjan MF20 (utspädning: 1/1000).
    5. Tvätta membranet 5x i 5 min med PBS-0,1% Tween 20, torka överskottet av vätska och tillsätt det kemiluminiscerande substratet. Fortsätt enligt rekommendationerna från substratleverantören för att detektera den kemiluminiscerande signalen.
  2. Funktionell karakterisering av redigerade kloner
    OBS: Funktionen av RyR1 bedömdes med hjälp av kalciumavbildning i differentierade myotubes, framställda av CTRL- eller KO-kloner14.
    1. Platta 50 000 celler på en 0,2 cm2 yta i mitten av 35 mm skålar belagda med laminin (yta täckt av en 50 μl laminindroppe, vid 10 mg / ml i PBS med kalcium) och inducera differentiering i 6 dagar enligt beskrivningen i steg 8.1.1. Förbered tre plattor för varje stimulering, för att få en biologisk tredubbling.
    2. Ladda myorören med 50 μl fluo 4-direkt, utspädd 1:1 i differentieringsmedium och inkuberad i 30 minuter vid 37 °C. Skölj cellerna två gånger med KREBS-buffert kompletterad med glukos vid 1 mg / ml.
    3. Mät fluorescensvariationerna med ett inverterat fluorescerande mikroskop eller ett konfokalmikroskop med ett 10x mål. Installera plattan på mikroskopets scen och starta förvärvet med 1 ram per sekund i 90 s.
    4. Ta bort de återstående KREBS och stimulera cellerna vid ram 25 genom tillsats av 2 ml KCl för membrandepolarisering (140 mM slutkoncentration) eller 2 ml 4 CmC (500 μM slutlig koncentration) för RyR1 direkt stimulering. Se till att minst 10 myotubes finns i det inspelade fältet.
    5. Kvantifiera fluorescensvariationen i varje myotube med hjälp av en dedikerad programvara. Välj för analys minst 10 myotubes per maträtt (helst 20-30 myotubes per maträtt), rita en linje (eller en region av intresse (ROI)) på den långa axeln för varje myotube och samla fluorescens F längs denna linje för alla ramar.
    6. Bestäm det ursprungliga fluorescerande värdet, F0, som motsvarar ramarna 1 till 24. Plotta den fluorescerande variationen (F-F0)/F0 som en funktion av tiden från 0 till 90 s. Upprepa experimentet tre gånger för att få fluorescensvariationen från minst 90 myotubes från tre olika kulturer. Slå samman alla resultat för de 90 myotubes och beräkna medelvärdet ± SEM för (F-F0) / F0 vid varje tidsram. Kvantifiera den maximala amplituden för kalciumfrisättning för varje stimulering och varje klon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Detta protokoll tillämpades på odödliga myoblaster från ett friskt ämne15 (så kallade HM-celler, för humana myoblaster), där RyR1 tidigare har karakteriserats16, för att slå ut RYR1-genen som kodar för RyR1-proteinet. Utformningen av guiderna RNA gjordes för att radera sekvensen som omfattar en del av exon 101 och intron 101 av genen. Radering av en del av exon 101 förutses leda till störningar i läsramen. Dessutom kodar exon 101 för proteinets por och krävs således för att producera en funktionell kalciumkanal. Många patienter som drabbats av en svår RyR1-relaterad myopati har en mutation i denna region av genen7. De bästa guiderna som förutspåddes med Crispor-programvaran valdes för att ha så få off-targets som möjligt, samtidigt som de behöll den bästa effektiviteten. Vi valde att använda två guider samtidigt i samma virala vektor, för att se till att en stor del av cellerna kommer att knock-out och för att underlätta upptäckten av raderingen i redigerade kloner med PCR. De två valda guiderna (se tabell 2 och figur 1) är lokaliserade i slutet av exon 101 respektive i början av intron 101, vilket resulterar i en radering av 326 bp och en efterföljande ramförskjutning. Detta säkerställer att de redigerade cellerna blir RYR1-KO.

GRNA som riktades mot SpCas9 var det som redan designades av Merienne och kollegor6 och fanns i plasmiden #87919 under den svaga promotorn 7SK. Eftersom dess effektivitet för att rikta in sig på SpCas9-sekvensen redan har visats i deras studie6, har den använts för att skapa plasmiden p_Killer, men under kontroll av den starka promotorn H1. Den andra guiden i p_Killer plasmid är utformad för att rikta in sig på mCherry-sekvensen under promotorn U6. Detta möjliggör radering av mCherry, vilket kan vara störande i vissa efterföljande experiment med den nyskapade cellinjen.

Plasmider p_guides och p_killer skapades och alla nödvändiga lentivirus producerades i det dedikerade BSL2-kulturrummet. Efter myoblasttransduktion odlades cellerna i 2 veckor tills tillväxtåterhämtning och analyserades med PCR för att bekräfta närvaron av redigerade celler. För cellulär kloning såddes två 96-brunnsplattor med behandlade celler vid 1 cell per brunn. Celltillväxt observerades i 32% av odlade brunnar. Genomiskt DNA extraherades sedan från klonerna och PCR-analys gjordes tills två korrigerade kloner identifierades (så kallade Cl-KOR-1 och Cl-KOR-2), se figur 3. Raderingen av den riktade delen av RYR1 bekräftades av Sanger-sekvensering. Ytterligare kontrollceller har använts, såsom de initiala HM-cellerna, eller HM-celler som behandlats med samma procedur men inte redigerats som bekräftat av PCR och sekvensering (Cl-CTRL). Utvalda kloner förstärktes sedan och karakteriserades ytterligare på proteinnivå och funktionsnivå.

För att validera fullständig utrotning av RyR1 och Cas9 på proteinnivå utfördes Western blot-analys. Resultaten presenteras i figur 4. Cas9-proteinet, frånvarande i HM-cellerna, detekterades 5 dagar efter transduktionen av cellerna med LV-Cas9 (HM+LV-Cas9), och som förväntat avskaffades dess uttryck i Cl-CTRL och i den redigerade Cl-KOR-1 och Cl-KOR-2, även om en liten mängd Cas9 fortfarande detekterades i Cl-KOR-2 (Figur 3A). Eftersom gRNA-inriktningen på Cas9 fortfarande uttrycks förväntas mängden återstående Cas9 gradvis försvinna. Uttrycket av andra viktiga proteiner bedömdes också med hjälp av Western blot: RyR1, för att bekräfta fullständig radering av proteinet, alfa1-underenheten av DHPR, som är den funktionella partnern för RyR1 som är involverad i excitation-kontraktionskoppling, och myosin-tung kedjan som en markör för differentiering, eftersom RyR1 och DHPR endast uttrycks i differentierade myotubes (Figur 3B ). DHPR och MYHC ska inte modifieras. Även om Western blot bekräftade den fullständiga raderingen av RyR1 i de två RyR1-KO-klonerna (Cl-KOR-1 och Cl-KOR-2), kan ytterligare modifieringar- som härrör från Cas9 eller från kloningsproceduren - ha inträffat i Cl-KOR-2, som dessutom presenterade en frånvaro av DHPR och en minskning av myosin tung kedja (MHC). Eftersom båda proteinerna endast uttrycks i differentierade myotubes, återspeglar deras frånvaro troligen förändring i differentiering, vilket möjligen kan härröra från det långa encelliga kloningsförfarandet associerat med en lokal överväxt av cellerna som leder till förlusten i deras myogena potential. Således har endast Cl-KOR-1 karakteriserats ytterligare på funktionell nivå. Detta visar att valet av många redigerade kloner är viktigt för att kunna arbeta med de bästa.

Den funktionella karakteriseringen utfördes med användning av kalciumavbildning. Den genomsnittliga fluorescensvariationen som en funktion av tiden representeras på figur 5, på minst 180 myorör av varje genotyp, med antingen en direkt RyR1-stimulering med 4-CMC eller stimulering av kalciumfrisättningskomplexet (DHPR associerat med RyR1) genom KCl-membrandepolarisering.

Dessa experiment visade att den icke-modifierade Cl-CTRL hade ett beteende som var jämförbart med den ursprungliga cellpopulationen (HM-celler) och svarade på direkt RyR1-stimulering genom dess aktivator 4-CmC och genom stimulering av kalciumfrisättningskomplexet genom membrandepolarisering. Däremot kunde den redigerade Cl-KOR-1 inte svara på någon av stimuleringarna (4-CmC och KCl depolarisering), som förväntat för en RyR1-KO.

Sammantaget bekräftade Western blot och den funktionella karakteriseringen att Cl-KOR-1-cellinjen är en RyR1-KO-muskelcelllinje. Detta protokoll kan tillämpas på alla andra gener som uttrycks i skelettmuskulatur eller annan celltyp (såsom inducerade pluripotenta stamceller - iPSC). Det fullständiga protokollet illustreras i figur 6.

Figure 1
Figur 1: Lokalisering och design av guiderna RNA. (A) Schematisk lokalisering av guiderna utformade för skapandet av RYR1-KO-cellinjen. Guide 1 riktar sig mot slutet av exon 101 i RYR1-genen , Guide 2 riktar sig mot intron 101, vilket skapar en radering av 326 bp och en ramförskjutning. Guide Killer riktar in sig på initieringskodonet i sekvensen av SpCas9, Guide mCherry riktar sig mot slutet av mCherry-sekvensen. (B) Lokalisering av guiderna i de genomiska sekvenserna för den tidigare beskrivna guide 1, guide 2, guidedödare och guide mCherry. Sekvensen för varje guide (20 bp lång) presenteras i färg och PAM för varje guide är fetstilt och understruket. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Kloningsförfarande för produktion av kassetten. Schematisk presentation av de olika PCR som utförs för att producera kassetterna med guiderna, som ska sättas in i lentivirus ryggradsplasmiden. PCR A, PCR B, PCR C och PCR D realiseras med program 1 illustrerat till höger och PCR-final med PCR-programmet 2, illustrerat till höger längst ner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Val av kloner med PCR. (A) Schematisk presentation av PCR-förstärkningen av ett 1 200 bp-område som omfattar guiderna, med framåt- och bakåtprimrar representerade av de grå pilarna. DNA-klyvning vid båda styrningarna förväntas resultera i en minskning av 326 bp i storleken på PCR-fragmentet, vilket framgår av de prickade gröna vertikala linjerna under saxen. (B) PCR-produkter tillverkade av HM-celler, Cl-CTRL, Cl-KOR-1 och Cl-KOR-2 laddades på en 1% agarosgel. DNA från HM och Cl-CTRL verkar icke-modifierat (full längd), medan DNA från Cl-KOR-1 och Cl-KOR-2 är kortare än kontrollen, som förväntat (klyvt). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Karakterisering av cellerna på proteinnivå. (A) Western blot-analys för närvaron av Cas 9-protein med användning av V5-taggen i HM-celler, HM-celler transducerade med LV-Cas9, Cl-CTRL, Cl-KOR-1 och Cl-KOR-2. Cas9 detekteras tydligt i HM-cellerna som transduceras med LV-Cas9, medan dess uttryck har avskaffats helt (i Cl-CTRL och Cl-KOR-1) eller nästan helt (i Cl-KOR-2) av LV-Killer. (B) Uttryck av RyR1, Myosin tung kedja (MYHC), alfa1-underenhet av DHPR och GAPDH som en lastkontroll i Cl-CTRL, Cl-KOR-1 och Cl-KOR-2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Funktionell karakterisering av cellerna. Fluo-4 kalciumavbildning utförd på myorör framställda från HM-celler, Cl-CTRL och Cl-KOR-1. Kurvorna representerar fluorescensvariationen i HM-myorör (svarta kurvor), Cl-CTRL-myorör (grå kurvor) eller Cl-KOR-1 (gröna kurvor). Alla värden presenteras som medelvärde ± standardfel av medelvärdet (SEM) av n myotubes. I varje tillstånd har n = 180 till 256 myotubes analyserats, från minst tre olika experiment (exakt antal anges för varje kurva). 4 CmC (500 μM) användes för att direkt stimulera RyR1 i närvaro av 2 mM externt kalcium. KCl-depolarisering (140 mM) inducerades i närvaro av 2 mM externt kalcium. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: Schematisk presentation av hela protokollet. De olika stegen i protokollet presenteras, från in silico-designen till in vitro-molekylär kloning och det slutliga cellvalet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Namn Sekvens 5'-3' Syfte/Användning
Primer_Guide1F Guide1 + gttttagagctagaaatagc Plasmidkloning
Primer_Guide1R Guide 1-RC + AGATCTGTGGTCTCATACAG
Primer_Guide 2F Guide 2 + gttttagagctagaaatagc
Primer_Guide 2R Guide 2-RC + GTTTCGTCCTTTCCACAAG
Primer_XmaI F TAGTGGATCCCCCGGGAAAATTCAAAATTTT Plasmidkloning och kolonier kontrollerar
Primer_BlpI R CGCTTCCATTGCTCAGCTGGCCGCTGCCCC
Primer_KillerF AATGGAGTACTTCTTGTCCAgttttagagctagaaatagc Kloning av p_Killer
Primer_KillerR TGGACAAGAAGTACTCCATTAGATCTGTGGTCTCATACAG
Primer_mCherryF GAACAGTACGAACGCGCCGAgtttagagctagaaatagc
Primer_mCherryR TCGGCGCGTTCGTACTGTTCGTTTCGTCCTTTCCACAAG
Primer_RYR1exonF GCTCGTATTCGTCACCCGCGgttttagagctagaaatagc Kloning av p_guides_RyR1
Primer_RYR1exonR CGCGGGTGACGAATACGAGCAGATCTGTGGTCTCATACAG
Primer_RYR1intronF TAAGTCAGTTCATAGGCGCTgttttagagctagaaatagc
Primer_RYR1intronR AGCGCCTATGAACTGACTTAGTTTCGTCCTTTCCACAAG
Primer_BeforeRYR1cut AGTCGTTACCATGTCTTCAGCCCT Klonval för RYR1 KO
Primer_AfterRYR1cut CTGCCGATTCCACAGATGAAGCAC

Tabell 1: Lista över primers. Primers som används för plasmidkloning och kolonikontroll, liksom de för klonvalet.

Namn Guide sekvens Pam Omvänd komplement utan PAM
Guide 1: RYR1exon GCTCGTATTCGTCACCCGCG GGG CGCGGGTGACGAATACGAGC
Guide 2: RYR1intron TAAGTCAGTTCATAGGCGCT CGG AGCGCCTATGAACTGACTTA
Guide Killer Cas9 TGGACAAGAAGTACTCCATT GGG AATGGAGTACTTCTTGTCCA
Guide mCherry mördare GAACAGTACGAACGCGCCGA GGG TCGGCGCGTTCGTACTGTTC

Tabell 2: Guider som används för att skapa plasmiden p_guides och p_Killer. Sekvenserna som används för utvecklingen av RyR1-KO-klonerna presenteras i denna tabell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ett viktigt steg på vägen mot karakterisering av gener med okänd funktion som är involverade i patologier är utvecklingen av relevanta cellulära modeller för att studera funktionen hos dessa gener. Användningen av genredigering med CRISPR/Cas9 är ett exponentiellt växande forskningsfält, och utvecklingen av knock-out-modeller som presenteras här är bland de mest använda applikationerna. I detta sammanhang föreslår vi här ett mångsidigt protokoll för att utveckla en mänsklig cellinje knock-out i vilken gen som helst av intresse, vilket möjliggör karakterisering av denna gen i en relevant mänsklig cellmodell. Protokollet som presenteras här kan användas i odödliga myoblaster såväl som i iPSC, och kan därmed praktiskt taget resultera i produktion av någon mänsklig cellmodell KO i genen av intresse.

Begränsningen är att detta protokoll bör tillämpas på odödliga celler, eftersom många veckors odling samt en cellulär kloning krävs tillsammans med många successiva förstärkningar. Alternativt bör celler, som kan förstärkas och bibehållas i några veckor eller månader användas. Med hjälp av denna procedur har humant odödliggjord muskelcellinje KO för genen av intresse (här RYR1-genen ) producerats på cirka 3-4 månader (exklusive cellernas funktionella karakterisering).

Denna strategi är lämplig för svåra att transfektera celler, såsom muskelceller, eftersom den är beroende av användningen av lentivirus för att införa alla verktyg i målcellerna, och den är därmed kraftfullare än andra metoder som transfektion eller elektroporering. Dess största nackdel är integration i värdgenomet, och ett möjligt alternativ för att undvika skadlig integration av lentivirus i värdgenomet är användningen på icke-integrativt lentivirus17, men effektiviteten hos dessa icke-integrativa lentivirala partiklar bör vara minst likvärdig med det vanliga lentiviruset.

Integrationssidan kan förmodligen påverka uttrycksnivån för Cas9, men detta är troligen inte ansvarigt för den lilla mängden Cas9 i Cl-KOR 2. Den lilla mängden Cas9 är troligen relaterad till transduktionen av denna specifika klon med LV-Killer, som kunde ha varit lägre än i den andra klonen, eller alternativt kunde antalet LV-Cas9 ha varit högre.

Det rekommenderas inte att uttrycka Cas9 ensam utan gRNA under lång tid (t.ex. för utveckling av en Cas9-klon), eftersom detta har beskrivits för att öka off-targets, och det kan också öka cellernas dödlighet.

Vi har valt att använda SpCas9 som nukleas, eftersom det används ofta, det har en kort PAM och erbjuder därför flera alternativ för val av guide RNA. Dessutom är dess storlek kompatibel med produktionen av lentivirala vektorer. Andra nukleaser kan användas om en specifik PAM måste riktas (t.ex. SaCas9 eller Cpf1)18.

De olika lentivirusen kan produceras i ett vanligt BSL2-odlingsrum19 eller köpas från en virusproduktionsanläggning eller ett företag. Kravet för att implementera detta protokoll är expertis inom molekylärbiologi och molekylär kloning, och i odling av den valda cellmodellen.

Lentivirusen som kodar för de olika guiderna kodar också för det fluorescerande proteinet, mCherry. Detta fluorescerande protein kan vara användbart, vilket möjliggör automatiserad sortering av cellerna och kloning av FACS istället för kloning av en cell, och i detta fall bör uttrycket av mCherry inte undertryckas med LV-mördaren. Om mCherry ska underhållas ska den andra guiden mot mCherry inte klonas till p-mördaren (steg 2.7). För RYR1-genen , eftersom den funktionella karakteriseringen använder fluorescerande sonder, och den framtida användningen av denna cellinje också kan kräva immunmärkning med fluorescerande antikroppar, har vi valt att undertrycka mCherry-uttryck. I LV-mördaren har gRNA-inriktningen på Cas9 placerats under en stark promotor H1 istället för den svaga promotorn 7SK som ursprungligen fanns i den ursprungliga plasmiden, för att säkerställa en liknande effektivitet hos nukleaset på alla utvalda gRNA och för att öka Cas9-klyvningen när LV-mördaren läggs till cellerna.

Det längsta och mest ansträngande steget är kloning av en cell. I vårt förfarande visade muskelcellerna en minskad tillväxt efter lentiviral transduktion med Cas9 och återhämtade sig efter några veckor. Om kloning av en cell utförs för tidigt efter de virala transduktionerna, förmodligen på grund av massiv celldöd, kommer endast några få brunnar på en 96-brunnsplatta att innehålla växande celler. Således är det bättre att förstärka cellerna före kloning och vänta på minst 2-3 splittring. Det är också möjligt att klona cellerna vid 10 celler / brunn om de inte växer bra som enskilda celler. Dessutom bör myoblasterna alltid odlas vid en sammanflöde under 50% för att upprätthålla en god differentieringsförmåga.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete finansierades av bidrag från Association Française contre les myopathies (AFM-Téléthon) och från Auvergne-Rhône Alpes Région (AURA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-CACNA1S antibody Sigma-Aldrich HPA048892 Primary antibody
Blp I NE BioLabs R0585S Restriction enzyme
CalPhos Mammalian Transfection Kit Takara 631312  Transfection kit
Easy blot anti Mouse IgG GeneTex GTX221667-01 HRP secondary antibody
Easy blot anti Rabbit IgG GeneTex GTX221666 HRP secondary antibody
Fluo-4 direct Molecular Probes F10472 Calcium imaging
GAPDH(14C10) Rabbit mAb  Cell Signaling Technology #2118 Primary antibody
HindIII Fermentas ER0501 Restriction enzyme
InFusion HD Precision Plus Takara 638920 Ligation kit
MasterMix Phusion High Fidelity with GC ThermoFisher Scientific F532L Mix for PCR reaction with High fidelity Taq polymerase and dNTPs
Myosin Heavy Chain antibody DHSB MF20 Primary antibody
NucleoBond Xtra Maxi EF Macherey-Nagel REF 740424 Maxipreparation kit for purification of plasmids
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Macherey-Nagel 740609 DNA purification
NucleoSpin Tissue Macherey-Nagel 740952 Kit for DNA extraction from cell
One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli ThermoFisher Scientific C737303 Chemically competent cells
Plasmid #87904 Addgene 87904 Lentiviral plasmid encoding the SpCas9 (for LV-Cas9)
Plasmid #87919 Addgene 87919 Lentiviral backbone for insertion of cassette with guides (for LV-guide-target)
Plasmid #12260 Addgene 12260 Lentiviral plasmid encoding lentiviral packaging GAG POL
Plasmid #8454 Addgene 8454 Lentiviral plasmid encoding envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles
V5 Tag Monoclonal Antibody Invitrogene R96025  Primary antibody
XL10-Gold Ultracompetent Cells Agilent 200317 Chemically competent cells
Xma I NE BioLabs R0180S Restriction enzyme

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Claussnitzer, M., Susztak, K. Gaining insight into metabolic diseases from human genetic discoveries. Trends in Genetics. 37 (12), 1081-1094 (2021).
  2. Fuster-García, C., García-Bohórquez, B., Rodríguez-Muñoz, A., Millán, J. M., García-García, G. Application of CRISPR tools for variant interpretation and disease modeling in inherited retinal dystrophies. Genes. 11 (5), 473 (2020).
  3. Modell, A. E., Lim, D., Nguyen, T. M., Sreekanth, V., Choudhary, A. CRISPR-based therapeutics: current challenges and future applications. Trends in Pharmacological Sciences. 43 (2), 151-161 (2022).
  4. Olson, E. N. Toward the correction of muscular dystrophy by gene editing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (22), (2021).
  5. Wu, X., Kriz, A. J., Sharp, P. A. Target specificity of the CRISPR-Cas9 system. Quantitative Biology. 2 (2), 59-70 (2014).
  6. Merienne, N., et al. The self-inactivating KamiCas9 system for the editing of CNS disease genes. Cell Reports. 20 (12), 2980-2991 (2017).
  7. Marty, I., Fauré, J. Excitation-contraction coupling alterations in myopathies. Journal of Neuromuscular Diseases. 3 (4), 443-453 (2016).
  8. Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
  9. Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. A quick, cost-free method of purification of DNA fragments from agarose gel. Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).
  10. Flucher, B. E., Conti, A., Takeshima, H., Sorrentino, V. Type 3 and type 1 ryanodine receptors are localized in triads of the same mammalian skeletal muscle fibers. The Journal of Cell Biology. 146 (3), 621-630 (1999).
  11. Hess, H. H., Lees, M. B., Derr, J. E. A linear Lowry--Folin assay for both water-soluble and sodium dodecyl sulfate-solubilized proteins. Analytical Biochemistry. 85 (1), 295-300 (1978).
  12. Garibaldi, M., et al. Dusty core disease' (DuCD): expanding morphological spectrum of RYR1 recessive myopathies. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 3 (2019).
  13. Marty, I., et al. Biochemical evidence for a complex involving Dihydropyridine receptor and Ryanodine receptor in triad junctions of skeletal muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2270-2274 (1994).
  14. Oddoux, S., et al. Triadin deletion induces impaired skeletal muscle function. Journal of Biological Chemistry. 284 (50), 34918-34929 (2009).
  15. Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skeletal Muscle. 1, 34 (2011).
  16. Cacheux, M., et al. Functional characterization of a central core disease RyR1 mutation (p.Y4864H) associated with quantitative defect in RyR1 protein. Journal of Neuromuscular Diseases. 2 (4), 421-432 (2015).
  17. Luis, A. The old and the new: Prospects for non-integrating lentiviral vector technology. Viruses. 12 (10), 1103 (2020).
  18. Leenay, R. T., Beisel, C. L. Deciphering, communicating, and engineering the CRISPR PAM. Journal of Molecular Biology. 429 (2), 177-191 (2017).
  19. Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protocols in Neurosciences. , Chapter 4, Unit 4.21 (2006).

Tags

Genetik utgåva 184
Utveckling av knock-out muskelcellinjer med Lentivirusmedierad CRISPR / Cas9-genredigering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Beaufils, M., Tourel, A., Petiot,… More

Beaufils, M., Tourel, A., Petiot, A., Halmai, N. B., Segal, D. J., Rendu, J., Marty, I. Development of Knock-Out Muscle Cell Lines using Lentivirus-Mediated CRISPR/Cas9 Gene Editing. J. Vis. Exp. (184), e64114, doi:10.3791/64114 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter