这里介绍的是使用即用型放射性标记合成子[89Zr]Zr-p-异硫氰酸基苄基-去铁胺([89Zr]Zr-DBN)用正电子发射断层扫描(PET)放射性同位素89Zr(t1/2 78.4 h)对细胞进行放射性标记的方案。用 [89Zr]Zr-DBN 放射性标记细胞允许在给药后长达 7 天内对体内 PET 中施用的放射性标记细胞进行无创跟踪和成像。
干细胞和嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法正在成为器官再生的有前途的疗法和各种癌症的免疫疗法。尽管在这些领域取得了重大进展,但仍需学习更多知识,以更好地了解生命系统中施用治疗细胞的药代动力学和药效学。对于使用正电子发射断层扫描 (PET) 对细胞进行非侵入性体内追踪,已经开发了一种利用 89 Zr (t1/2 78.4 h) 的新型 [89Zr]Zr-p-异硫氰酸基苄基-去铁胺 ([89Zr]Zr-DBN) 介导的细胞放射性标记方法。本方案描述了一种[89Zr]Zr-DBN介导的即用型放射性标记合成子,用于直接放射性标记各种细胞,包括间充质干细胞、谱系引导的造心干细胞、肝脏再生肝细胞、白细胞、黑色素瘤细胞和树突状细胞。所开发的方法能够在给药后长达 7 天内对细胞运输进行无创 PET 成像,而不会影响放射性标记细胞的性质或功能。此外,该协议描述了[89Zr]Zr-DBN的放射合成,[89Zr]Zr-DBN的生物相容性制剂,用于放射性标记的细胞的制备,以及最后用[89Zr]Zr-DBN对细胞进行放射性标记的逐步方法,包括成功放射性标记细胞所需的所有复杂细节。
干细胞和嵌合抗原受体 (CAR) T 细胞疗法越来越受欢迎,并正在积极研究用于治疗各种疾病,例如心肌衰竭1,2、视网膜变性 2、黄斑变性 2、糖尿病 2、心肌梗塞3、4、5 和癌症6、7、8、9,10.在干细胞疗法的两种合理方法中,干细胞可以直接移植到疾病部位引起治疗反应,也可以引起疾病部位微环境的变化而不粘附在疾病部位以启动间接治疗反应。间接治疗反应可以通过释放修复或治疗疾病的因子来引起疾病部位微环境的变化5.这些干细胞治疗方法可以通过放射性标记干细胞的无创成像来评估。无创成像可以将疾病部位放射性标记细胞的摄取与治疗反应相关联,以破译直接与间接治疗反应。
此外,基于免疫细胞的疗法正在开发中,以使用 CAR T 细胞6、7、8、9、10 和树突状细胞免疫疗法11,12 治疗各种癌症。从机制上讲,在CAR T细胞免疫疗法6,7,8,9,10中,T细胞被设计为表达与需要治疗的肿瘤上的特定抗原结合的表位。这些工程化的CAR T细胞在给药时,通过表位-抗原相互作用与肿瘤细胞上存在的特异性抗原结合。结合后,结合的CAR T细胞发生激活,然后增殖并释放细胞因子,细胞因子向宿主的免疫系统发出信号,攻击表达特异性抗原的肿瘤。相反,在树突状细胞疗法11,12的情况下,树突状细胞被设计成在其表面呈递特定的癌症抗原。这些经过工程改造的树突状细胞在给药时是淋巴结的家园,并与淋巴结中的T细胞结合。T细胞在与施用的树突状细胞上的特定癌症抗原结合后,发生激活/增殖,并启动宿主对表达该特定抗原的肿瘤的免疫反应。因此,通过对放射性标记的CAR T细胞和树突状细胞进行成像来评估给药的CAR T细胞向肿瘤部位的运输9,10以及树突状细胞归巢到淋巴结11,12以确定免疫疗法的疗效。此外,非侵入性细胞运输可以帮助更好地了解治疗潜力,阐明直接与间接治疗反应,并预测和监测干细胞和基于免疫细胞的疗法的治疗反应。
已经探索了细胞运输的不同成像方式 3,4,9,10,12,包括光学成像、磁共振成像 (MRI)、单光子发射计算机断层扫描 (SPECT) 和正电子发射断层扫描 (PET)。这些技术中的每一种都有自己的优点和缺点。其中,PET因其定量性和高灵敏度而成为最有前途的方法,这对于基于成像的细胞运输中的细胞可靠定量至关重要3,4,9,10。
正电子发射放射性同位素89Zr,半衰期为78.4 h,适用于细胞标记。它允许对细胞运输进行 PET 成像超过 1 周,并且很容易由广泛使用的低能量医用回旋加速器13、14、15、16、17 产生。此外,市售的对异硫氰酸基苄基去铁胺 (DFO-Bn-NCS) 螯合剂可用于合成 89 Zr 标记的即用型细胞标记合成子 [89 Zr]Zr-p-异硫氰酸基苄基去铁胺,也称为 [89Zr]Zr-DBN 18,19,20,21,22,23,24,25.[89Zr]Zr-DBN 介导的细胞标记原理基于细胞膜蛋白的伯胺与 [89Zr]Zr-DBN 的异硫氰酸酯 (NCS) 部分之间的反应,以产生稳定的共价硫脲键。
[89锆]基于 Zr-DBN 的细胞标记和成像已发表,用于追踪各种不同的细胞,包括干细胞 18、23、25、树突状细胞18、造心干细胞19、蜕膜基质细胞 20、骨髓来源的巨噬细胞 20、外周血单核细胞 20、Jurkat/CAR T 细胞 21、肝细胞22、24 和白细胞 25.以下方案提供了使用[89Zr]Zr-DBN制备和细胞放射性标记的分步方法,并描述了特定细胞类型的放射性标记方案中可能需要的变化。为了更清楚起见,这里介绍的细胞放射性标记方法分为四个部分。第一部分涉及通过将 89Zr 与 DFO-Bn-NCS 螯合来制备 [89Zr]Zr-DBN。第二部分描述了[89Zr]Zr-DBN的生物相容性制剂的制备,该制剂可以很容易地用于细胞放射性标记。第三部分介绍了用于放射性标记的细胞预处理所需的步骤。细胞的预处理包括用无蛋白磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 和 HEPES 缓冲的 Hanks 平衡盐溶液 (H-HBSS) 洗涤细胞,以去除外部蛋白质,这些蛋白质可能会干扰或竞争 [89Zr]Zr-DBN 与细胞表面蛋白质上存在的伯胺的反应在放射性标记过程中。最后一部分提供了细胞实际放射性标记和质量控制分析所涉及的步骤。
以下是方案中需要优化以实现有效细胞放射性标记的关键步骤。在方案步骤1.2和1.3中,根据所采用的[89Zr]Zr(HPO4)2或[89Zr]ZrCl4的体积,必须使用适当体积(微升)的碱;1.0 M K 2CO 3 溶液必须用于中和 [89 Zr]Zr(HPO 4)2,1.0 M Na2CO 3 溶液用于中和 [89Zr]ZrCl4,以达到 7.5-8.0 的 pH 范围。在步骤2…
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了 NIH 5R21HL127389-02、NIH 4T32HL007111-39、NIH R01HL134664 和 DOE DE-SC0008947 资助、维也纳国际原子能机构、妙佑医疗国际核医学科放射科和明尼苏达州罗切斯特梅奥诊所再生医学中心的支持。所有数字都是使用 BioRender.com 创建的。
Acetonitrile | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | A996-4 | |
Alpha Minimum Essential Medium | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | 12571063 | |
Anion exchange column | Macherey-Nagel, Inc., Düren, Germany | 731876 | Chromafix 30-PS-HCO3 SPE 45 mg cartridge |
Conical centrifuge tubes (15 mL) | Corning Inc., Glendale, AZ, USA | 352096 | Falcon 15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes |
Dendritic cells | The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | CRL-11904 | |
DFO-Bn-NCS | Macrocyclics, Inc., Plano, TX, USA | B-705 | p-SCN-Bn-Deferoxamine |
DMSO | Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO | 276855 | |
Dose calibrator | Mirion Technologies (Capintec), Inc., Florham Park, NJ, USA | 5130-3234 | CRC -55tR Dose Calibrator |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium | The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | 30-2002 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | 30-2020 | |
Hanks Balanced Salt solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | 14025092 | For preparation of H-HBSS |
Hydrochloric Acid (trace metal basis grade) | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | A508P212 | |
Melanoma cells | The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | CRL-6475 | |
Methanol | Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO | 34860 | |
Microcentrifuge tube | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30108442 | Protein LoBind microcentrifuge tube |
Murine GM-CSF | R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN USA | 415-ML-010 | |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | 15140-122 | |
Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | 10010023 | For washing cells |
Saline | Covidien LLC, Mansfield, MA, USA | 1020 | 0.9% Sterile Saline Solution |
Shaker | Eppendorf, Hamburg, Germany | T1317 | Thermomixer |
Silica gel-rad-TLC paper sheet | Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA | SGI0001 | iTLC-SG |