Positronen-Emissions-Tomographie-Bildgebung des Zelltransports: Eine Methode der radioaktiven Markierung von Zellen

Summary

Hier wird ein Protokoll zur radioaktiven Markierung von Zellen mit einem Positronen-Emissions-Tomographie (PET)-Radioisotop, 89 Zr (t_1/2 78,4 h), unter Verwendung eines gebrauchsfertigen radioaktiv markierenden Synthons, [89 Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamin ([⁸⁹Zr]Zr-DBN), vorgestellt. Die radioaktive Markierung von Zellen mit [⁸⁹Zr]Zr-DBN ermöglicht die nicht-invasive Verfolgung und Bildgebung von radioaktiv markierten Zellen im Körper mit PET für bis zu 7 Tage nach der Verabreichung.

Abstract

Stammzell- und chimäre Antigenrezeptor (CAR)-T-Zell-Therapien entwickeln sich zu vielversprechenden Therapeutika für die Organregeneration und als Immuntherapie für verschiedene Krebsarten. Trotz erheblicher Fortschritte in diesen Bereichen gibt es noch mehr zu lernen, um die Pharmakokinetik und Pharmakodynamik der verabreichten therapeutischen Zellen im lebenden System besser zu verstehen. Für die nicht-invasive, in vivo Verfolgung von Zellen mit Positronen-Emissions-Tomographie (PET) wurde eine neuartige [89 Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamin ([89 Zr]Zr-DBN)-vermittelte Zellradiomarkierungsmethode unter Verwendung von ⁸⁹Zr (t_1/2 78,4 h) entwickelt. Das vorliegende Protokoll beschreibt ein [⁸⁹Zr]Zr-DBN-vermitteltes, gebrauchsfertiges, radioaktiv markierendes Synthon für die direkte radioaktive Markierung einer Vielzahl von Zellen, einschließlich mesenchymaler Stammzellen, liniengesteuerter kardiopoetischer Stammzellen, leberregenerierender Hepatozyten, weißer Blutkörperchen, Melanomzellen und dendritischen Zellen. Die entwickelte Methodik ermöglicht eine nicht-invasive PET-Bildgebung des Zelltransports für bis zu 7 Tage nach der Verabreichung, ohne die Beschaffenheit oder Funktion der radioaktiv markierten Zellen zu beeinträchtigen. Darüber hinaus beschreibt dieses Protokoll eine schrittweise Methode für die Radiosynthese von [89 Zr]Zr-DBN, die biokompatible Formulierung von [89 Zr]Zr-DBN, die Vorbereitung von Zellen für die radioaktive Markierung und schließlich die radioaktive Markierung von Zellen mit [⁸⁹Zr]Zr-DBN, einschließlich aller komplizierten Details, die für die erfolgreiche radioaktive Markierung von Zellen erforderlich sind.

Introduction

Stammzell- und chimäre Antigenrezeptor (CAR)-T-Zell-Therapien gewinnen an Popularität und werden aktiv für die Behandlung verschiedener Krankheiten wie Myokardversagen^1,2, Netzhautdegeneration 2, Makuladegeneration 2, Diabetes ², Myokardinfarkt 3,4,5 und Krebs 6,7,8,9 untersucht^.10. Unter den beiden plausiblen Ansätzen von Stammzelltherapien können Stammzellen entweder direkt auf die Krankheitsstelle transplantiert werden, um eine therapeutische Reaktion hervorzurufen, oder Veränderungen in der Mikroumgebung der Krankheitsstelle verursachen, ohne an der Krankheitsstelle zu haften, um eine indirekte therapeutische Reaktion auszulösen. Ein indirektes therapeutisches Ansprechen könnte Veränderungen in der Mikroumgebung des Krankheitsortes verursachen, indem Faktoren freigesetzt werden, die die Krankheit reparieren oder behandeln würden⁵. Diese Ansätze von Stammzelltherapien konnten durch nicht-invasive Bildgebung von radioaktiv markierten Stammzellen evaluiert werden. Die nicht-invasive Bildgebung könnte die Aufnahme der radioaktiv markierten Zellen an der Krankheitsstelle mit einem therapeutischen Ansprechen korrelieren, um das direkte und indirekte therapeutische Ansprechen zu entschlüsseln.

Darüber hinaus werden immunzellbasierte Therapien entwickelt, um verschiedene Krebsarten mit CAR-T-Zellen 6,7,8,9,10 und dendritischen Zellimmuntherapien ^11,12 zu behandeln. Mechanistisch werden T-Zellen in der CAR-T-Zell-Immuntherapie 6,7,8,9,10 so verändert, dass sie ein Epitop exprimieren^, das an ein spezifisches Antigen auf Tumoren bindet^, das behandelt werden muss. Diese gentechnisch veränderten CAR-T-Zellen binden nach der Verabreichung durch eine Epitop-Antigen-Interaktion an das spezifische Antigen, das auf den Tumorzellen vorhanden ist. Nach der Bindung werden die gebundenen CAR-T-Zellen aktiviert, vermehren sich dann und setzen Zytokine frei, die dem Immunsystem des Wirts signalisieren, den Tumor anzugreifen, der das spezifische Antigen exprimiert. Im Gegensatz dazu werden dendritische Zellen im Falle von dendritischen Zelltherapien^11,12 so verändert, dass sie ein spezifisches Krebsantigen auf ihrer Oberfläche präsentieren. Diese manipulierten dendritischen Zellen besiedeln bei der Verabreichung die Lymphknoten und binden an die T-Zellen in den Lymphknoten. Die T-Zellen durchlaufen nach der Bindung an die spezifischen Krebsantigene auf den verabreichten dendritischen Zellen eine Aktivierung/Proliferation und initiieren eine Immunantwort des Wirts gegen den Tumor, der dieses spezifische Antigen exprimiert. Daher ist die Beurteilung des Transports von verabreichten CAR-T-Zellen zu einer Tumorstelle^9,10 und des Homings von dendritischen Zellen zu den Lymphknoten^11,12 durch die Bildgebung von radioaktiv markierten CAR-T-Zellen und dendritischen Zellen möglich, um die Wirksamkeit der Immuntherapie zu bestimmen. Darüber hinaus kann der nicht-invasive Zelltransport dazu beitragen, das therapeutische Potenzial besser zu verstehen, das direkte und indirekte therapeutische Ansprechen zu klären und das therapeutische Ansprechen sowohl von Stammzell- als auch von Immunzell-basierten Therapien vorherzusagen und zu überwachen.

Es wurden verschiedene bildgebende Modalitäten für den Zelltransport untersucht 3,4,9,10,12, darunter optische Bildgebung^, Magnetresonanztomographie (MRT), Einzelphotonenemissions-Computertomographie (SPECT) und Positronen-Emissions-Tomographie (PET). Jede dieser Techniken hat ihre eigenen Vor- und Nachteile. Unter diesen ist PET aufgrund ihrer quantitativen Natur und hohen Sensitivität, die für die zuverlässige Quantifizierung von Zellen im bildgebenden Zelltransport unerlässlich sind, die vielversprechendste Modalität 3,4,9,10.

Das Positronen-emittierende Radioisotop ⁸⁹Zr mit einer Halbwertszeit von 78,4 h eignet sich für die Zellmarkierung. Es ermöglicht die PET-Bildgebung des Zelltransports über 1 Woche lang und wird von weit verbreiteten, energiearmen medizinischen Zyklotronen 13,14,15,16,17 leicht hergestellt. Darüber hinaus ist ein entsprechend funktionalisierter, p-Isothiocyanatobenzyl-Desferrioxamin (DFO-Bn-NCS)-Chelator für die Synthese eines 89 Zr-markierten, gebrauchsfertigen, zellmarkierenden Synthons, [89 Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamin, auch bekannt als [⁸⁹Zr]Zr-DBN 18,19,20,21,22,23,24, kommerziell erhältlich^,25. Das Prinzip der [89 Zr]Zr-DBN-vermittelten Zellmarkierung basiert auf einer Reaktion zwischen primären Aminen von Zellmembranproteinen und dem Isothiocyanat (NCS)-Teil von [⁸⁹Zr]Zr-DBN, um eine stabile kovalente Thioharnstoffbindung zu erzeugen.

[⁸⁹Zr] Zr-DBN-basierte Zellmarkierung und Bildgebung wurden veröffentlicht, um eine Vielzahl verschiedener Zellen zu verfolgen, darunter Stammzellen 18,23,25, dendritische Zellen¹⁸, kardiopoetische Stammzellen¹⁹, deziduale Stromazellen 20, aus dem Knochenmark stammende Makrophagen 20, mononukleäre Zellen des peripheren Blutes 20, Jurkat/CAR-T-Zellen 21, Hepatozyten ^22,24 und weiße Blutkörperchen ²⁵. Das folgende Protokoll enthält Schritt-für-Schritt-Methoden zur Präparation und Radiomarkierung von Zellen mit [⁸⁹Zr]Zr-DBN und beschreibt Änderungen, die im Radiomarkierungsprotokoll für einen bestimmten Zelltyp erforderlich sein können. Zur besseren Übersichtlichkeit ist die hier vorgestellte Methode der radioaktiven Zellmarkierung in vier Abschnitte unterteilt. Der erste Abschnitt befasst sich mit der Herstellung von [89 Zr]Zr-DBN durch Chelatbildung von ⁸⁹Zr mit DFO-Bn-NCS. Der zweite Abschnitt beschreibt die Herstellung einer biokompatiblen Formulierung von [⁸⁹Zr]Zr-DBN, die leicht für die radioaktive Markierung von Zellen verwendet werden kann. Der dritte Abschnitt behandelt die Schritte, die für die Vorkonditionierung von Zellen für die radioaktive Markierung erforderlich sind. Die Vorkonditionierung der Zellen beinhaltet das Waschen der Zellen mit proteinfreier phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und HEPES-gepufferter Hanks-Salzlösung (H-HBSS), um externe Proteine zu entfernen, die die Reaktion von [⁸⁹Zr]Zr-DBN mit primären Aminen, die während der radioaktiven Markierung auf den Proteinen der Zelloberfläche vorhanden sind, stören oder mit ihr konkurrieren könnten. Der letzte Abschnitt beschreibt die Schritte der eigentlichen radioaktiven Markierung der Zellen und der Analyse der Qualitätskontrolle.

Protocol

Dendritische Zellen und Melanomzellen wurden kommerziell gewonnen18. Hepatozyten wurden nach laparoskopischer partieller Hepatektomie aus der Leber von Schweinen isoliert22,24. Die Stammzellen wurden aus Knochenmarkaspiraten isoliert18,19,26. Die aus dem Fettgewebe gewonnenen Stammzellen wurden aus dem Human Cellular Therapy Laboratory, Mayo Clini…

Representative Results

Die repräsentativen Ergebnisse, die in diesem Manuskript vorgestellt werden, wurden aus den vorangegangenen [89Zr]Zr-DBN-Synthese- und Zellradiomarkierungsstudienzusammengestellt 18,19,22,23,24,25. Kurz gesagt, 89Zr können erfolgreich mit DFO-Bn-NCS in ~30-60 min bei 25-37 °C unter Verwendung von 7,5-…

Discussion

Im Folgenden sind wichtige Schritte im Protokoll aufgeführt, die für eine effektive Radiomarkierung von Zellen optimiert werden müssen. In den Protokollschritten 1.2 und 1.3 muss je nach verwendetem Volumen von [89 Zr]Zr(HPO4)₂ oder [⁸⁹Zr]ZrCl4 ein geeignetes Volumen (Mikroliter) Base verwendet werden; 1,0 M_{K2CO3-Lösung} muss für die Neutralisation von [89 Zr]Zr(HPO4)₂ und 1,0 M Na2CO3-Lösung für die Neutralisation von [_</s…

Materials

Acetonitrile	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	A996-4
Alpha Minimum Essential Medium	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	12571063
Anion exchange column	Macherey-Nagel, Inc., Düren, Germany	731876	Chromafix 30-PS-HCO3 SPE 45 mg cartridge
Conical centrifuge tubes (15 mL)	Corning Inc., Glendale, AZ, USA	352096	Falcon 15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes
Dendritic cells	The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	CRL-11904
DFO-Bn-NCS	Macrocyclics, Inc., Plano, TX, USA	B-705	p-SCN-Bn-Deferoxamine
DMSO	Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO	276855
Dose calibrator	Mirion Technologies (Capintec), Inc., Florham Park, NJ, USA	5130-3234	CRC -55tR Dose Calibrator
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	30-2002
Fetal Bovine Serum (FBS)	The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	30-2020
Hanks Balanced Salt solution (HBSS)	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	14025092	For preparation of H-HBSS
Hydrochloric Acid (trace metal basis grade)	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	A508P212
Melanoma cells	The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	CRL-6475
Methanol	Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO	34860
Microcentrifuge tube	Eppendorf, Hamburg, Germany	30108442	Protein LoBind microcentrifuge tube
Murine GM-CSF	R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN USA	415-ML-010
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	15140-122
Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	10010023	For washing cells
Saline	Covidien LLC, Mansfield, MA, USA	1020	0.9% Sterile Saline Solution
Shaker	Eppendorf, Hamburg, Germany	T1317	Thermomixer
Silica gel-rad-TLC paper sheet	Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA	SGI0001	iTLC-SG