Detta protokoll beskriver en uppsättning metoder för att syntetisera mikrogelbyggstenarna för mikroporös glödgad partikelställning, som kan användas för en mängd olika regenerativa medicinska applikationer.
Den mikroporösa glödgade partikelplattformen (MAP) är en underklass av granulära hydrogeler. Den består av en injicerbar uppslamning av mikrogeler som kan bilda en strukturellt stabil byggnadsställning med cellskalans porositet in situ efter ett sekundärt ljusbaserat kemiskt tvärbindningssteg (dvs. glödgning). MAP-ställningen har visat framgång i en mängd olika applikationer för regenerativ medicin, inklusive dermal sårläkning, röstveckförstoring och stamcellsleverans. Denna uppsats beskriver metoderna för syntes och karakterisering av poly(etylenglykol) (PEG) mikrogeler som byggstenar för att bilda en MAP-ställning. Dessa metoder inkluderar syntesen av en anpassad glödgningsmakromer (MethMAL), bestämning av mikrogelprekursorgeleringskinetik, tillverkning av mikrofluidiska anordningar, mikrofluidisk generering av mikrogeler, mikrogelrening och grundläggande ställningskaraktärisering, inklusive mikrogelstorlek och ställningsglödgning. Specifikt kan de mikrofluidiska metoder med hög genomströmning som beskrivs häri producera stora volymer mikrogeler som kan användas för att generera MAP-byggnadsställningar för önskad applikation, särskilt inom regenerativ medicin.
MAP-ställningsplattformen är ett injicerbart biomaterial som helt består av hydrogelmikropartiklar (mikrogeler) som ger mikroporositet i cellskala när de är tvärbundna tillsammans, vilket möjliggör nedbrytningsoberoende cellmigration och bulkvävnadsintegration1. På grund av dess förmåga att snabbt integreras med värdvävnad och i sig låg immunogenicitet har MAP-ställningsplattformen visat preklinisk tillämplighet för en mängd olika regenerativa läkemedelsterapier 2,3,4,5,6,7,8,9,10, inklusive accelererande dermal sårläkning 1,3 ,11, revaskulariserande hjärnslaghåla7, leverera mesenkymala stamceller2 och tillhandahålla vävnadsbulk för att behandla glottisk insufficiens6. MAP har också visat sig förmedla antiinflammatoriska effekter till värdvävnad genom rekrytering av M2-makrofager3 och kan till och med ställas in för att främja ett Th2 “vävnadsreparation” immunsvar8. Dessa gynnsamma egenskaper hos MAP-ställningsplattformen gör att den kan utökas till ett brett spektrum av kliniska applikationer.
Tidigare publicerade metoder för att generera mikrogeler för MAP-ställningsbildning har inkluderat flödesfokuserande droppmikrofluidik 1,4,7,9, elektrosprutning 5,12 och overheadspinning med batchemulsion 6,10. Droppmikrofluidikmetoden kan producera partiklar med hög monodispersitet men använder mycket långsamma flödeshastigheter som ger låga utbyten av partiklar (μL/h). Alternativt kan elektrosprutnings- och batchemulsionsmetoderna producera en hög volym partiklar, men med hög partikelpolydispersitet. Detta protokoll använder en mikrofluidisk metod med hög genomströmning för att producera mikrogeler med en monodisperspopulation, baserat på arbete av de Rutte et al13. Denna metod använder mjuka litografitekniker för att göra en polydimetylsiloxan (PDMS) mikrofluidisk enhet från en fotomask, som sedan binds till en glasskiva. Enhetsdesignen är beroende av stegemulgering för att generera en hög volym mikrogelpartiklar (ml / h). Den monodispersitet som kan uppnås med denna metod ger överlägsen kontroll av porositet jämfört med andra tekniker, eftersom monodispersmikrogeler kan bilda byggnadsställningar med mer enhetliga porstorlekar2.
Metoderna för att syntetisera och karakterisera de enskilda mikrogelerna som kan fungera som byggstenar för MAP-ställningar beskrivs i detta manuskript, särskilt när det gäller att skapa mikrogeler som består av en PEG-ryggrad med en maleimid (MAL) -grupp, som lätt deltar i effektiv tillägg av Michael-typ med tiolfunktionaliserade tvärbindare för mikrogelgelering. För att frikoppla mikrogelgelering från MAP-ställningsglödgning beskriver detta manuskript också hur man syntetiserar en publicerad14 anpassad glödgningsmakromer, MethMAL, som är en heterofunktionell metakrylamid / maleimid 4-arm PEG-makromer. De metaakrylamidfunktionella grupperna deltar lätt i fotopolymerisation av fria radikaler (för mikrogelglödgning), samtidigt som de förblir relativt inerta mot de förhållanden som främjar tillägg av Michael-typ för MAL-funktionella grupper.
Dessutom beskriver detta manuskript protokollen för att skapa PDMS-mikrofluidiska enheter, bestämma mikrogelgeleringskinetik och karakterisera mikrogelstorlek. Den sista delen av manuskriptet beskriver MAP-ställningsglödgning, vilket är när mikrogelerna övergår på plats till en bulkställning genom ett sekundärt, fotoinitierat tvärbindningssteg som kovalent binder samman mikrogelernas ytor. Det är viktigt att notera att det finns andra glödgningsmetoder som kan implementeras i MAP-ställningssystem som inte är beroende av ljusbaserade kemier, såsom enzymmedierad glödgning, som tidigare beskrivits1. Sammantaget kan dessa metoder användas direkt eller användas med olika hydrogelformuleringskemier (t.ex. hyaluronsyrabaserade) för att generera MAP-ställningar för alla applikationer.
Detta protokoll beskriver metoder för att syntetisera och karakterisera mikrogeler, som fungerar som byggstenar för mikroporösa glödgade partiklar (MAP) ställningar. Detta protokoll använder ett mikrofluidiskt tillvägagångssätt med hög genomströmning för att generera stora volymer enhetliga mikrogeler, vilket inte kan uppnås med andra metoder såsom flödesfokuserande mikrofluidik 1,4,7,9 (hög monodisperisty, lågt utbyte), batchemulsion 6,10 och elektrosprutning 5,12 (låg monodispersitet, högt utbyte). Med de metoder som beskrivs häri kan monodisperse mikrogeler göras för användning i MAP-ställningar som kan användas för en mängd olika regenerativa medicinska applikationer (t.ex. cellleverans, sårläkning).
Ett kritiskt steg i detta protokoll är skapandet av PDMS-mikrofluidikanordningarna. Om enheterna inte tillverkas korrekt kan detta ha negativa nedströmseffekter på mikrogelbildning och monodispersitet. Det är viktigt att förhindra införandet av artefakter (dvs bubblor, damm) i PDMS innan det härdar, eftersom detta kan täppa till kanalerna och avsevärt påverka mikrogelbildningen. För att mildra detta så mycket som möjligt bör man använda tejp för att ta bort damm, förvara enheterna i en dammfri behållare och arbeta i en dammfri huva, om möjligt. Det rekommenderas också att förvara enheterna vid 60 °C för bästa resultat med ytbehandlingen.
Vid hällning av PDMS-enheterna är det viktigt att upprätthålla en jämn tjocklek som är ungefär lika med eller mindre än längden på biopsistansen. Om enheten är för tjock kommer biopsistansen inte att kunna tränga igenom hela vägen. Det är också viktigt att inte riva PDMS-enhetens inlopp / utlopp medan du stansar med biopsistansen och / eller sätter in slangar. En rivning i PDMS-enheten kommer att orsaka läckage från inloppen / utloppet, vilket kan orsaka förlust av gelprekursorlösningen. Om det läcker ut i en PDMS-enhet är den bästa lösningen att ersätta den med en ny enhet så snabbt som möjligt.
Vid plasmabehandling av enheten har användningen av rent syre och plasmabehandling i 30 s gett de bästa resultaten för att fästa PDMS på glasskivan. Om enheten inte binder korrekt (dvs. PDMS kan fortfarande lyftas från glasskivan efter plasmabehandling) bör man dubbelkontrollera att plasmabehandlaren fungerar korrekt och att enheten och bilderna har rengjorts noggrant. Det är också viktigt att använda rätt silanytbehandling, och för bästa resultat bör PDMS-enheterna ytbehandlas direkt före användning. Andra metoder för ytbehandling, såsom kemisk ångavsättning, kan också användas.
Ett annat viktigt steg är att använda PDMS-mikrofluidikenheterna korrekt för mikrogelbildning. Det rekommenderas att använda ett flödeshastighetsförhållande på minst 2: 1 (detta protokoll använder en 6 ml / h oljeflödeshastighet och en 3 ml / h vattenflödeshastighet), men detta kan ställas in för att uppnå önskad mikrogelstorlek. PH för mikrogelprekursorlösningen är också ett viktigt mått att optimera för att förhindra igensättning av enheten. Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) accelererar tiolatbildning i tillsatskemi av Michael-typ, och PBS-koncentrationerna som används i detta protokoll ger de bästa resultaten för mikrogelgelering i mikrofluidiska anordningar. När sprutpumparna har startats kan det finnas några bubblor i de mikrofluidiska kanalerna, men detta bör balansera efter några minuter. Det rekommenderas att övervaka mikrogelbildning med ett mikroskop. Om flödet inte ser ut som i den här videon och/eller om det finns några kanaler som producerar stora partiklar beror det troligen på problem med ytbehandlingssteget. Den bästa lösningen är att ersätta enheten med en som nyligen har ytbehandlats.
Om mikrogelerna verkar vara sammansmältande kan detta bero på en otillräcklig koncentration av fluortensid. Den rekommenderade lösningen är att öka viktprocenten av ytaktivt ämne i oljefasen. En begränsning med att använda höga koncentrationer av ytaktivt ämne är dock att det kan vara svårare att avlägsna under reningssteget. Det rekommenderas att endast använda mikrofluidiska enheter en gång, men enheterna kan återanvändas om de spolas med Nove-olja omedelbart efter användning för att ta bort vattenlösning som kan gela i enheten och täppa till kanalerna. Medan en mikrofluidisk enhet kan producera en volym mikrogeler med hög genomströmning (ml / h), kan denna produktionshastighet skalas genom att använda flera mikrofluidiska enheter parallellt.
Glödgningssteget för MAP-ställningsmontering är beroende av användningen av en ljusaktiverad fotoinitiator av radikalpolymerisation, och fotoinitiatorn kan väljas baserat på önskad applikation. Till exempel har LAP-fotoinitiatorn snabba glödgningstider (<30 s) vid användning av långvågigt UV-ljus, vilket har minimal inverkan på cellviabiliteten in vitro14. Denna våglängd absorberas emellertid starkt av vävnad16 och kanske inte har lika hög glödgningseffekt in vivo som in vitro.
Eosin Y är en annan fotoinitiator som aktiveras av synliga våglängder (505 nm) och har djupare penetration i vävnad, vilket förbättrar MAP-ställningens förmåga att glödgas under vävnad. De långa ljusexponeringstiderna som behövs för Eosin Y-glödgning kan dock förlänga cellexponeringen för fria radikaler och påverka cellviabiliteten in vitro14. Genom att använda dessa metoder för högkapacitetsgenerering av mycket enhetliga mikrogelbyggstenar kommer det att påskynda MAP-ställningsfokuserad forskning och främja kunskap inom området injicerbara porösa material för regenerativ medicin.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill erkänna Joe de Rutte och Di Carlo Lab vid University of California, Los Angeles, för deras hjälp med den ursprungliga mikrofluidiska enhetsdesignen som den rapporterade enheten utvecklades från, liksom deras tidiga vägledning i PDMS-enhetstillverkning och felsökning. Figurscheman skapades med Biorender.com.
2-aminoethanethiol hydrochloride | Acros Organics | AC153770250 | For MethMal Synthesis MW: 113.61 Da |
35 mm plate rotor | HAAKE | P35/Ti | Geometry for HAAKE viscometer |
4-arm PEG-Maleimide (10 kDa) | NOF AMERICA Corporation | SUNBRIGHT PTE-100MA | For microgel precursor solution |
4-arm PEG-Maleimide (20 kDa) | NOF AMERICA Corporation | SUNBRIGHT PTE-200MA | For MethMal Synthesis Molecular weight specific to each batch |
BD Syringe with Luer-Lok Tips | Becton Dickinson | Disposable plastic syringes | |
Biopsy punch | Mitex | MLTX33-31A-P/25 | 1.5 mm diameter |
Chloroform-d | Acros Organics | AC209561000 | For MethMal Synthesis |
Collimated LED Light Source | ThorLabs | M365LP1-C1 | 365 nm |
Culture dish (15 cm) | Corning | CLS430599 | 150 mm x 25 mm |
DMTMM(4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methyl-morpholinium chloride) | Oakwood Chemical | 151882 | For MethMal Synthesis MW: 276.72 Da |
Fluorosurfactant | Ran Technologies | 008-Flurosurfactant-5wtH-200G | 5 weight percent of 008-Flurosurfactant in HFE7500 |
FreeZone Triad Freeze Dry System | Labconco | 7400000 Series | For MethMal Synthesis Lyophilizer |
Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | Plain glass slides, uncoated |
HAAKE Rheowin viscometer | HAAKE | ||
ImageJ | version 1.8.0_172 | ||
KDS Legato 210 Dual Prong Syringe Pump | Kd Scientific | ||
LED Driver | ThorLabs | DC2200 | |
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma-Aldrich | 900889 | Photoinitiator |
Methacrylic Acid | Sigma Aldrich | 155721 | For MethMal Synthesis MW: 86.09 Da Density: 1.015g/mL |
Microfluidic device SU8-Si master wafer | FlowJem | N/A | Custom-made, with silanization |
MMP-2 degradable crosslinker | FlowJem | Sequence: Ac-GCGPQGIAGQDGCG-NH2 | |
Needles (25 G, beveled) | BD | 305122 | Length: 15.88 mm Gauge: 0.5 mm |
Novec 7500 | 3M | 7100025016 | Fluorinated oil |
Oxygen | Praxair | UN1072 | Compressed |
Peek tubing | Trajan Scientific | 03-350-523 | 1/32" Outer Diameter; 0.02" Inner Diameter; 10' Length |
PFOCTS (trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane) | Sigma-Aldrich | 448931 | For surface treatment |
Phosphate Buffered Saline | Fisher BioReagants | BP3994 | Diluted to 1x in ultrapure water, pH = 7.4 |
Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001-HP | |
Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
RGD cell adhesive peptide | WatsonBio Sciences | Sequence: Ac-RGDSPGGC-NH2 | |
Rheowin software | HAAKE | Software compatible with HAAKE viscometer | |
Scalpel blade | Bard-Parker | 371210 | Size: #10 |
Scalpel handle | Bard-Parker | 371030 | Size: #3 |
Sodium Chloride | Fisher BioReagents | BP358-1 | For MethMal Synthesis MW: 58.44 Da |
Sylgard 184 silicone elastomer kit | DOW Chemical | 2065622 | Base and curing agent |
Triethylamine | Fisher Scientific | O4884-100 | For MethMal Synthesis MW: 101.19 Da Density: 0.73g/mL |
Tygon tubing | Saint Gobain Performance Plastics | AAD04103 | ID: 0.51 mm OD: 1.52 mm |
Varian Inova 500 Spectrometer | Varian | NMR Located in the UVA Biomolecular Magnetic Resonance Facility |