בניית מודל של איבר-על-שבב של תא שריר חלק של אבי העורקים לשחזור זן ביומכני בדופן אבי העורקים
Summary
כאן פיתחנו מודל של איבר על-שבב של תאי שריר חלקים באבי העורקים כדי לשכפל את הזן הביומכני in vivo של תאי שריר חלקים בדופן אבי העורקים האנושי.
Abstract
טכניקות קונבנציונליות של תרביות תאים דו-ממדיות ומודלים של בעלי חיים שימשו במחקר של מפרצת ודיסקציה של אבי העורקים החזי האנושי (TAAD). עם זאת, TAAD אנושי לפעמים לא יכול להיות מאופיין על ידי מודלים של בעלי חיים. קיים פער מינים לכאורה בין מחקרים קליניים בבני אדם לבין ניסויים בבעלי חיים שעשויים לעכב גילוי של תרופות טיפוליות. לעומת זאת, מודל תרבית התאים הקונבנציונלי אינו מסוגל לדמות גירויים ביומכניים in vivo . לשם כך, טכניקות מיקרו-פבריקציה ומיקרופלואידיות התפתחו מאוד בשנים האחרונות, ומספקות טכניקות חדשניות לביסוס מודלים של אורגנואידים על שבב המשכפלים את המיקרו-סביבה הביומכנית. במחקר זה פותח מודל של איבר-על-שבב של תאי שריר חלקים של אבי העורקים (HASMC-OOC) כדי לדמות את הפרמטרים הפתופיזיולוגיים של ביומכניקה של אבי העורקים, כולל המשרעת והתדירות של מאמץ מחזורי שחווים תאי שריר חלק באבי העורקים האנושי (HASMCs) הממלאים תפקיד חיוני ב-TAAD. במודל זה, המורפולוגיה של HASMCs התארכה בצורתה, התיישרה בניצב לכיוון המתח, והציגה פנוטיפ מתכווץ יותר בתנאי מאמץ מאשר בתנאים קונבנציונליים סטטיים. זה עלה בקנה אחד עם כיוון התא והפנוטיפ בדפנות אבי העורקים האנושי המקומי. בנוסף, תוך שימוש ב-TAAD (BAV-TAAD) הקשור למסתם אבי העורקים ו-TAAD (TAV-TAAD) הקשור למסתם אבי העורקים טריקוספיד שמקורו בחולי HASMCs, הקמנו מודלים של מחלות BAV-TAAD ו-TAV-TAAD, המשכפלים את מאפייני HASMC ב-TAAD. מודל HASMC-OOC מספק פלטפורמה חדשנית במבחנה המשלימה מודלים של בעלי חיים להמשך חקר הפתוגנזה של TAAD וגילוי מטרות טיפוליות.
Introduction
מפרצת ודיסקציה של אבי העורקים החזי (TAAD) היא הרחבה מקומית או דלמינציה של דופן אבי העורקים הקשורה לתחלואה גבוהה ותמותה1. תאי שריר חלק באבי העורקים האנושי (HASMCs) ממלאים תפקיד חיוני בפתוגנזה של TAAD. HASMCs אינם תאים ממוינים באופן סופני, ו- HASMCs שומרים על פלסטיות גבוהה, מה שמאפשר להם להחליף פנוטיפים בתגובה לגירויים שונים2. HASMCs נתונים בעיקר למתח מתיחה קצבי in vivo, וזהו אחד הגורמים המרכזיים המווסתים שינויים מורפולוגיים בשרירים חלקים, התמיינות ותפקודים פיזיולוגיים 3,4. לכן, לא ניתן להתעלם מתפקידו של זן מחזורי בחקר ה- HASMCs. עם זאת, תרביות תאים דו-ממדיות קונבנציונליות אינן יכולות לשכפל את הגירוי הביומכני של זן מחזורי שחווים HASMCs in vivo. בנוסף, בניית מודל TAAD של בעלי חיים אינה מתאימה לסוגים מסוימים של TAAD, כגון TAAD הקשור לשסתום אבי העורקים הביקוספיד (BAV). יתר על כן, לא ניתן להתעלם מהפער בין מחקרים קליניים בבני אדם לניסויים בבעלי חיים. זה מעכב את התרגום הפרמצבטי בפרקטיקה הקלינית. לפיכך, יש צורך דחוף במערכות מורכבות ופיזיולוגיות יותר כדי לדמות את הסביבה הביומכנית in vivo במחקר של מחלות אבי העורקים.
ניסויים בבעלי חיים המשמשים במחקר ביו-רפואי ובפיתוח תרופות הם יקרים, גוזלים זמן ומוטלים בספק מבחינה אתית. בנוסף, התוצאות ממחקרים בבעלי חיים לעתים קרובות אינן מצליחות לחזות את התוצאות המתקבלות בניסויים קליניים בבני אדם 5,6. היעדר מודלים פרה-קליניים אנושיים ושיעור הכישלון הגבוה בניסויים קליניים הביאו למעט תרופות יעילות למרפאה, מה שהגדיל את עלויות הטיפול הרפואי7. לכן, דחוף למצוא מודלים ניסיוניים אחרים כדי להשלים מודלים של בעלי חיים. טכניקות מיקרו-פבריקציה ומיקרופלואידיות התפתחו מאוד בשנים האחרונות, ומספקות טכניקות חדשניות לביסוס מודלים של אורגנואידים על שבב המתקן את החסרונות של טכניקות מסורתיות של תרביות תאים דו-ממדיות ומבססים מודל in-vitro מציאותי יותר, בעלות נמוכה ויעילה יותר למחקרים פיזיולוגיים ופיתוח תרופות. באמצעות התקנים מיקרופלואידיים, איברים על שבבים נוצרים כדי לתרבת תאים חיים בתאים בגודל מיקרומטר עם גירויים שונים כדי לשכפל את הפונקציות העיקריות של רקמה או איבר. המערכת מורכבת ממיקרו-תעלות מיקרופלואידיות בודדות או מרובות, כאשר סוג אחד של תאים מתרבית בתא משוכפל פונקציות מסוג רקמה אחד או סוגי תאים שונים בתרבית על ממברנות נקבוביות כדי ליצור מחדש ממשקים בין רקמות שונות. לאורגנואידים מבוססי מיקרופלואידיקה בשילוב עם תאים שמקורם בחולה יש יתרון ייחודי של גישור על ההבדלים בין המינים הגדולים בין מודלים של מחלות עכברים ובני אדם והתגברות על החסרונות של תרבית תאים דו-ממדית מסורתית לצורך מחקר מנגנוני מחלה וגילוי תרופות. עם ההתפתחות המהירה של מיקרופלואידיקה בשנים האחרונות, חוקרים הבינו את התועלת של מודלים של איבר על שבב (OOC) במבחנה המשכפלים פרמטרים ביולוגיים מורכבים in vivo 8. אורגנואידים מיקרופלואידיים אלה מדמים סביבות ביומכניות במבחנה, כגון מתח מחזורי, עקת גזירה ולחץ נוזלי, ומספקים סביבת תרבית תאים תלת-ממדית (3D). עד כה, מספר מודלים OOC הוקמו כדי לדמות גירויים ביומכניים באיברים כגון הריאה9, כליה 10, כבד11, המעי 12, ולב 13, אבל אלה לא יושמו באופן נרחב על המחקר של מחלת אבי העורקים האנושי.
במחקר זה, אנו מציגים מודל של איבר-על-שבב של תאי שריר חלקים של אבי העורקים האנושי (HASMC-OOC) שיכול לשלוט בכוחות ובמקצבים המכניים הביומימטיים המופעלים על HASMCs ראשוניים שמקורם ב-TAAD. השבב מורכב מלוחות עבים תלת-שכבתיים של פולידימתילסילוקסן (PDMS) החרוטים בתעלות ושני ממברנות PDMS ממוסחרות וגמישות במיוחד. HASMCs מתורבתים על ממברנות PDMS. הערוץ במרכז השבב מלא במדיום תרבית לתרבית תאים. הערוצים העליונים והתחתונים של השבב מחוברים למערכת אספקת לחץ ואקום שיכולה לשלוט בקצב ובתדירות של מתח מתיחה מכני של ממברנות PDMS. ניתן לדמות זן קצבי שחווים HASMCs ב-HASMC-OOC, תוך שכפול המיקרו-סביבה הביומכנית של רקמה או איבר שאינם ניתנים להשגה פונקציונלית עם מערכות תרבית דו-ממדיות קונבנציונליות. עם היתרון של הדמיה בזמן אמת ברזולוציה גבוהה ומיקרו-סביבה ביומכנית, ניתן לחקור את הפעילויות הביוכימיות, הגנטיות והמטבוליות של תאים חיים להתפתחות רקמות, פיזיולוגיה של איברים, אטיולוגיה של מחלות, מנגנונים מולקולריים וזיהוי סמנים ביולוגיים, מחלות לב וכלי דם ומחלות אבי העורקים. בשילוב עם תאים ספציפיים לרקמות ולמטופלים, מערכת זו יכולה לשמש לבדיקת תרופות, רפואה מותאמת אישית ובדיקות רעילות. מודל HASMC-OOC זה מספק פלטפורמה חדשנית במבחנה לחקר הפתוגנזה של מחלת אבי העורקים.
Protocol
Representative Results
Discussion
עם ההתפתחות המהירה של טכנולוגיה מיקרופלואידית, מודלים של OOC שיכולים לשכפל את התפקוד הביולוגי והמבנה של איבר אחד או יותר במבחנה התפתחו בשנים האחרונות ליישומים בביולוגיה, רפואה ופרמקולוגיה15. OOC יכול לדמות תפקודים מרכזיים של המיקרו-סביבה הפיזיולוגית האנושית, החיוניים לחקר…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מכירים בכך שעבודה זו נתמכה על ידי מענקים מוועדת המדע והטכנולוגיה של עיריית שנגחאי (20ZR1411700), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81771971) ותוכנית השייט של שנגחאי (22YF1406600).
Materials
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0099-100ml | Used for cell immobilization |
| Alexa Fluor 350-labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0408 | Antibodies used for immunostaining |
| Bovine serum albumin | Beyotime | ST025-20g | |
| Calcium AM/PI | Invitrogen | L3224 | |
| Cell culture flask | Corning | 430639 | |
| CNN1 | Abcam | Ab46794 | |
| Commercial flexible PDMS membrane |
Hangzhou Bald Advanced Materials | KYQ-200 | |
| F-actin | Invitrogen | R415 | |
| FBS | Sigma | M8318 | |
| Hoses | Runze Fluid | 96410 | 1 mm inner diameter; 3 mm outer diameter; 1 mm wall thickness; Official website address: https://www.runzefluidsystem.com |
| Human aortic smooth muscle cell line CRL1999 |
ATCC | Lot Number:70019189 | |
| Image J | Imagej.net/fiji/downloads | Free Download: https://fiji.sc | Imaging platform that is used to identify fluorescence intensity |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | Ensures that the temperature, humidity, and light exposure is exactly the same throughout experiment. |
|
| Luer | Runze Fluid | RH-M016 | Official website address: https://www.runzefluidsystem.com. |
| Microscope | Olympus | ||
| mouse collagen | Sigma | C7661 | |
| Oxygen plasma | Changzhou Hongming Instrument | HM-Plasma5L | |
| Pasteur pipette | Biologix | 30-0138A1 | |
| PBS | Beyotime | C0221A | |
| Pen-Strep | Sigma | P4458-100ml | Antibiodics used to prevent bacterial contamination of cells during culture. |
| peristaltic pump | Kamoer | F01A-STP-B046 | |
| Petri dish | Corning | 430167 | |
| PLC controller | Zhejiang Jun Teng (BenT) CNC factory | BR010-11T8X2M | The detailed program setting can be found in supplementary. Official website address: files.http://www.btcnc.net |
| polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| SM22 | Abcam | ab14106 | |
| SMCM | ScienCell | Cat 1101 | |
| solenoid valve | SMC (China) | VQZ300 | |
| Syringe | Becton,Dickinson and Company | 300841 | |
| Triton-X 100 | Beyotime | ST795 | To penetrate cell membranes |
| Trizol | Invitrogen | 10296010 | Used for RNA extraction |
| trypsin | Sigma | 15400054 | |
| vacuum filter | SMC (China) | ZFC5-6 | Official website address: https://www.smc.com.cn |
| vacuum pump | Kamoer | KVP15-KL-S | |
| vacuum regulator | AirTAC | GVR-200-06 | |
| Primers | |||
| Primer Name | Forward (5’ to 3’) | Reverse (5’ to 3’) | |
| SM22 | CCGTGGAGATCCCAACTGG | CCATCTGAAGGCCAATGACAT | |
| CNN1 | CTCCATTGACTCGAACGACTC | CAGGTCTGCGAAACTTCTTAGA |
Riferimenti
- Olsson, C., Thelin, S., Ståhle, E., Ekbom, A., Granath, F. Thoracic aortic aneurysm and dissection: increasing prevalence and improved outcomes reported in a nationwide population-based study of more than 14,000 cases from 1987 to 2002. Circulation. 114 (24), 2611-2618 (2006).
- van Varik, B. J., et al. Mechanisms of arterial remodeling: lessons from genetic diseases. Frontiers in Genetics. 3 (290), 1-10 (2012).
- Halka, A. T., et al. The effects of stretch on vascular smooth muscle cell phenotype in vitro. Cardiovascular Pathology. 17 (2), 98-102 (2008).
- Wang, Y., et al. Arterial wall stress induces phenotypic switching of arterial smooth muscle cells in vascular remodeling by activating the YAP/TAZ signaling pathway. Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (2), 842-853 (2018).
- Fabre, K., et al. Introduction to a manuscript series on the characterization and use of microphysiological systems (MPS) in pharmaceutical safety and ADME applications. Lab on a Chip. 20, 1049-1057 (2020).
- Golding, H., Khurana, S., Zaitseva, M. What is the predictive value of animal models for vaccine efficacy in humans? The importance of bridging studies and species-independent correlates of protection. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (4), 028902 (2018).
- Ingber, D. E. Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine. Nature Reviews. Genetics. 25, 1-25 (2022).
- Niu, L., et al. Microfluidic chip for odontoblasts in vitro. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (9), 4844-4851 (2019).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1 (69), 1-25 (2017).
- Yoon No, D., Lee, K. H., Lee, J., Lee, S. H. 3D liver models on a microplatform: well-defined culture, engineering of liver tissue and liver-on-a-chip. Lab on a Chip. 15 (19), 3822-3837 (2015).
- Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).
- Jastrzebska, E., Tomecka, E., Jesion, I. Heart-on-a-chip based on stem cell biology. Biosensors & Bioelectronics. 75 (1), 67-81 (2016).
- Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity. Netherlands Heart Journal. 15 (3), 100-108 (2007).
- Perestrelo, A. R., Águas, A. C., Rainer, A., Forte, G. Microfluidic organ/body-on-a-chip devices at the convergence of biology and microengineering. Sensors. 15 (12), 31142-31170 (2015).
- Liu, Y., et al. Construction of cancer-on-a-chip for drug screening. Drug Discovery Today. 26 (8), 1875-1890 (2021).
- Yang, Q., et al. Design of organ-on-a-chip to improve cell capture efficiency. International Journal of Mechanical Sciences. 209, 106705 (2021).
- Yang, Q., Lian, Q., Xu, F. Perspective: Fabrication of integrated organ-on-a-chip via bioprinting. Biomicrofluidics. 11 (3), 031301 (2017).
- Mohammed, M. I., et al. Fabrication of microfluidic devices: improvement of surface quality of CO2 laser machined poly (methylmethacrylate) polymer. Journal of Micromechanics and Microengineering. 27 (1), 015021 (2017).
- Tsao, C. W. Polymer microfluidics: Simple, low-cost fabrication process bridging academic lab research to commercialized production. Micromachines. 7 (12), 225-236 (2016).
- Kirschbaum, S. E., Baeumner, A. J. A review of electrochemiluminescence (ECL) in and for microfluidic analytical devices. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (14), 3911-3926 (2015).
- Stefanadis, C., et al. Pressure-diameter relation of the human aorta. A new method of determination by the application of a special ultrasonic dimension catheter. Circulation. 92 (8), 2210-2219 (1995).
- Williams, B. Mechanical influences on vascular smooth muscle cell function. Journal of Hypertension. 16 (12), 1921-1929 (1998).
- Abudupataer, M., et al. Aorta smooth muscle-on-a-chip reveals impaired mitochondrial dynamics as a therapeutic target for aortic aneurysm in bicuspid aortic valve disease. eLife. 10, 69310 (2021).
- Poussin, C., et al. 3d human microvessel-on-a-chip model for studying monocyte-to-endothelium adhesion under flow – application in systems toxicology. Altex. 1, 47-63 (2020).
- Yasotharan, S., Pinto, S., Sled, J. G., Bolz, S., Gunther, A. Artery-on-a-chip platform for automated, multimodal assessment of cerebral blood vessel structure and function. Lab on a Chip. 15, 2660-2669 (2015).
