Konstruktion av en human aorta glatt muskelcell organ-on-a-chip modell för rekapitulering av biomekanisk belastning i aortaväggen
Summary
Här utvecklade vi en human aorta glattmuskelcell organ-on-a-chip-modell för att replikera den in vivo biomekaniska stammen av glattmuskelceller i den mänskliga aortaväggen.
Abstract
Konventionella tvådimensionella cellodlingstekniker och djurmodeller har använts i studien av human thoraxaortaaneurysm och dissektion (TAAD). Men mänsklig TAAD kan ibland inte karakteriseras av djurmodeller. Det finns ett uppenbart artgap mellan kliniska studier på människa och djurförsök som kan hindra upptäckten av terapeutiska läkemedel. Däremot kan den konventionella cellodlingsmodellen inte simulera in vivo biomekaniska stimuli. För detta ändamål har mikrofabrikation och mikrofluidiktekniker utvecklats kraftigt under de senaste åren och gett nya tekniker för att etablera organoider-på-ett-chip-modeller som replikerar den biomekaniska mikromiljön. I denna studie utvecklades en human aorta glattmuskelcell organ-on-a-chip (HASMC-OOC) modell för att simulera de patofysiologiska parametrarna för aortabiomekanik, inklusive amplituden och frekvensen av cyklisk belastning som upplevs av humana aorta glattmuskelceller (HASMCs) som spelar en viktig roll i TAAD. I denna modell blev morfologin hos HASMC långsträckt i form, justerad vinkelrätt mot töjningsriktningen och presenterade en mer kontraktil fenotyp under töjningsförhållanden än under statiska konventionella förhållanden. Detta överensstämde med cellorienteringen och fenotypen i infödda mänskliga aortaväggar. Dessutom, med hjälp av bicuspid aortaklaffrelaterad TAAD (BAV-TAAD) och tricuspid aortaklaffrelaterad TAAD (TAV-TAAD) patient-härledd primär HASMCs, etablerade vi BAV-TAAD och TAV-TAAD sjukdomsmodeller, som replikerar HASMC-egenskaper i TAAD. HASMC-OOC-modellen tillhandahåller en ny in vitro-plattform som kompletterar djurmodeller för att ytterligare utforska patogenesen av TAAD och upptäcka terapeutiska mål.
Introduction
Thoraxaortaaneurysm och dissektion (TAAD) är en lokaliserad dilatation eller delaminering av aortaväggen som är förknippad med hög sjuklighet och dödlighet1. Mänskliga aorta glattmuskelceller (HASMC) spelar en viktig roll i patogenesen av TAAD. HASMC är inte terminalt differentierade celler, och HASMC behåller hög plasticitet, vilket gör att de kan byta fenotyper som svar på olika stimuli2. HASMC utsätts huvudsakligen för rytmisk dragspänning in vivo, och detta är en av de viktigaste faktorerna som reglerar glattmuskelmorfologiska förändringar, differentiering och fysiologiska funktioner 3,4. Därför kan rollen av cyklisk stam i studien av HASMC inte ignoreras. Konventionella 2D-cellkulturer kan emellertid inte replikera den biomekaniska stimuleringen av cyklisk stam som upplevs av HASMC in vivo. Dessutom är konstruktionen av en TAAD-modell för djur inte lämplig för vissa typer av TAAD, såsom bicuspid aortaklaffen (BAV) -relaterad TAAD. Dessutom kan artklyftan mellan kliniska studier på människa och djurförsök inte ignoreras. Det hindrar läkemedelsöversättning i klinisk praxis. Således finns det ett brådskande behov av mer komplexa och fysiologiska system för att simulera den biomekaniska miljön in vivo i forskningen om aortasjukdomar.
Djurförsök som används inom biomedicinsk forskning och läkemedelsutveckling är kostsamma, tidskrävande och etiskt tveksamma. Dessutom misslyckas resultaten från djurstudier ofta med att förutsäga de resultat som erhållits i kliniska prövningar på människa 5,6. Bristen på humana prekliniska modeller och hög felfrekvens i kliniska prövningar har resulterat i få effektiva läkemedel för kliniken, vilket har ökat sjukvårdskostnaderna7. Därför är det angeläget att hitta andra experimentella modeller som komplement till djurmodeller. Mikrofabrikation och mikrofluidiktekniker har utvecklats mycket under de senaste åren och ger nya tekniker för att etablera organoider-på-ett-chip-modeller som avhjälper nackdelarna med traditionella 2D-cellodlingstekniker och etablerar en mer realistisk, billig och effektiv in vitro-modell för fysiologiska studier och läkemedelsutveckling. Med hjälp av mikrofluidiska anordningar etableras organ-på-chips för att odla levande celler i mikrometerstora kamrar med olika stimuli för att replikera nyckelfunktionerna hos en vävnad eller ett organ. Systemet består av enstaka eller flera mikrofluidiska mikrokanaler, där antingen en typ av cell odlas i en perfuserad kammare som replikerar funktioner av en vävnadstyp eller olika celltyper odlade på porösa membran för att återskapa gränssnitt mellan olika vävnader. Mikrofluidikbaserade organoider i kombination med patient-härledda celler har den unika fördelen att överbrygga den stora artskillnaden mellan mus- och mänskliga sjukdomsmodeller och övervinna nackdelarna med traditionell 2D-cellodling för sjukdomsmekanismforskning och läkemedelsupptäckt. Med den snabba utvecklingen av mikrofluidik under de senaste åren har forskare insett användbarheten av in vitro-organ-on-a-chip (OOC) -modeller som replikerar komplexa in vivo biologiska parametrar8. Dessa mikrofluidiska organoider simulerar in vitro biomekaniska miljöer, såsom cyklisk stam, skjuvspänning och vätsketryck, vilket ger en tredimensionell (3D) cellodlingsmiljö. Hittills har flera OOC-modeller etablerats för att simulera biomekaniska stimuli i organ som lungan9, njure 10, lever 11, tarm12 och hjärta 13, men dessa har inte tillämpats i stor utsträckning för studier av mänsklig aortasjukdom.
I denna studie presenterar vi en human aorta glattmuskelcell organ-on-a-chip (HASMC-OOC) modell som kan styra de biomimetiska mekaniska krafter och rytmer som tillämpas på TAAD patient-härledda primära HASMCs. Chipet består av treskiktade tjocka plattor av polydimetylsiloxan (PDMS) etsade med kanaler och två kommersialiserade mycket flexibla PDMS-membran. HASMC odlas på PDMS-membranen. Kanalen i mitten av chipet är fylld med ett odlingsmedium för cellodling. Chipets övre och nedre kanaler är anslutna till ett vakuumtryckförsörjningssystem som kan styra rytmen och frekvensen för mekanisk dragspänning hos PDMS-membranen. Rytmisk belastning som upplevs av HASMC kan simuleras i HASMC-OOC, vilket replikerar den biomekaniska mikromiljön hos vävnad eller organ som inte är funktionellt uppnåeliga med konventionella 2D-odlingssystem. Med fördelen av högupplöst, realtidsavbildning och biomekanisk mikromiljö kan de biokemiska, genetiska och metaboliska aktiviteterna hos levande celler studeras för vävnadsutveckling, organfysiologi, sjukdomsetiologi, molekylära mekanismer och biomarköridentifiering, hjärt-kärlsjukdom och aortasjukdom. I kombination med vävnadsspecifika och patientceller kan detta system användas för läkemedelsscreening, personlig medicin och toxicitetstestning. Denna HASMC-OOC-modell ger en ny in vitro-plattform för att studera patogenesen av aortasjukdomen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Med den snabba utvecklingen av mikrofluidisk teknik har OOC-modeller som kan replikera den biologiska funktionen och strukturen hos ett eller flera organ in vitro dykt upp de senaste åren för tillämpningar inom biologi, medicin och farmakologi15. OOC kan simulera nyckelfunktioner i den mänskliga fysiologiska mikromiljön, vilket är viktigt för att utforska sjukdomsmekanismer och främja preklinisk läkemedelsöversättning 8,16</s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna erkänner att detta arbete stöddes av bidrag från Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (20ZR1411700), National Natural Science Foundation of China (81771971) och Shanghai Sailing Program (22YF1406600).
Materials
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0099-100ml | Used for cell immobilization |
| Alexa Fluor 350-labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0408 | Antibodies used for immunostaining |
| Bovine serum albumin | Beyotime | ST025-20g | |
| Calcium AM/PI | Invitrogen | L3224 | |
| Cell culture flask | Corning | 430639 | |
| CNN1 | Abcam | Ab46794 | |
| Commercial flexible PDMS membrane |
Hangzhou Bald Advanced Materials | KYQ-200 | |
| F-actin | Invitrogen | R415 | |
| FBS | Sigma | M8318 | |
| Hoses | Runze Fluid | 96410 | 1 mm inner diameter; 3 mm outer diameter; 1 mm wall thickness; Official website address: https://www.runzefluidsystem.com |
| Human aortic smooth muscle cell line CRL1999 |
ATCC | Lot Number:70019189 | |
| Image J | Imagej.net/fiji/downloads | Free Download: https://fiji.sc | Imaging platform that is used to identify fluorescence intensity |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | Ensures that the temperature, humidity, and light exposure is exactly the same throughout experiment. |
|
| Luer | Runze Fluid | RH-M016 | Official website address: https://www.runzefluidsystem.com. |
| Microscope | Olympus | ||
| mouse collagen | Sigma | C7661 | |
| Oxygen plasma | Changzhou Hongming Instrument | HM-Plasma5L | |
| Pasteur pipette | Biologix | 30-0138A1 | |
| PBS | Beyotime | C0221A | |
| Pen-Strep | Sigma | P4458-100ml | Antibiodics used to prevent bacterial contamination of cells during culture. |
| peristaltic pump | Kamoer | F01A-STP-B046 | |
| Petri dish | Corning | 430167 | |
| PLC controller | Zhejiang Jun Teng (BenT) CNC factory | BR010-11T8X2M | The detailed program setting can be found in supplementary. Official website address: files.http://www.btcnc.net |
| polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| SM22 | Abcam | ab14106 | |
| SMCM | ScienCell | Cat 1101 | |
| solenoid valve | SMC (China) | VQZ300 | |
| Syringe | Becton,Dickinson and Company | 300841 | |
| Triton-X 100 | Beyotime | ST795 | To penetrate cell membranes |
| Trizol | Invitrogen | 10296010 | Used for RNA extraction |
| trypsin | Sigma | 15400054 | |
| vacuum filter | SMC (China) | ZFC5-6 | Official website address: https://www.smc.com.cn |
| vacuum pump | Kamoer | KVP15-KL-S | |
| vacuum regulator | AirTAC | GVR-200-06 | |
| Primers | |||
| Primer Name | Forward (5’ to 3’) | Reverse (5’ to 3’) | |
| SM22 | CCGTGGAGATCCCAACTGG | CCATCTGAAGGCCAATGACAT | |
| CNN1 | CTCCATTGACTCGAACGACTC | CAGGTCTGCGAAACTTCTTAGA |
Riferimenti
- Olsson, C., Thelin, S., Ståhle, E., Ekbom, A., Granath, F. Thoracic aortic aneurysm and dissection: increasing prevalence and improved outcomes reported in a nationwide population-based study of more than 14,000 cases from 1987 to 2002. Circulation. 114 (24), 2611-2618 (2006).
- van Varik, B. J., et al. Mechanisms of arterial remodeling: lessons from genetic diseases. Frontiers in Genetics. 3 (290), 1-10 (2012).
- Halka, A. T., et al. The effects of stretch on vascular smooth muscle cell phenotype in vitro. Cardiovascular Pathology. 17 (2), 98-102 (2008).
- Wang, Y., et al. Arterial wall stress induces phenotypic switching of arterial smooth muscle cells in vascular remodeling by activating the YAP/TAZ signaling pathway. Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (2), 842-853 (2018).
- Fabre, K., et al. Introduction to a manuscript series on the characterization and use of microphysiological systems (MPS) in pharmaceutical safety and ADME applications. Lab on a Chip. 20, 1049-1057 (2020).
- Golding, H., Khurana, S., Zaitseva, M. What is the predictive value of animal models for vaccine efficacy in humans? The importance of bridging studies and species-independent correlates of protection. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (4), 028902 (2018).
- Ingber, D. E. Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine. Nature Reviews. Genetics. 25, 1-25 (2022).
- Niu, L., et al. Microfluidic chip for odontoblasts in vitro. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (9), 4844-4851 (2019).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1 (69), 1-25 (2017).
- Yoon No, D., Lee, K. H., Lee, J., Lee, S. H. 3D liver models on a microplatform: well-defined culture, engineering of liver tissue and liver-on-a-chip. Lab on a Chip. 15 (19), 3822-3837 (2015).
- Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).
- Jastrzebska, E., Tomecka, E., Jesion, I. Heart-on-a-chip based on stem cell biology. Biosensors & Bioelectronics. 75 (1), 67-81 (2016).
- Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity. Netherlands Heart Journal. 15 (3), 100-108 (2007).
- Perestrelo, A. R., Águas, A. C., Rainer, A., Forte, G. Microfluidic organ/body-on-a-chip devices at the convergence of biology and microengineering. Sensors. 15 (12), 31142-31170 (2015).
- Liu, Y., et al. Construction of cancer-on-a-chip for drug screening. Drug Discovery Today. 26 (8), 1875-1890 (2021).
- Yang, Q., et al. Design of organ-on-a-chip to improve cell capture efficiency. International Journal of Mechanical Sciences. 209, 106705 (2021).
- Yang, Q., Lian, Q., Xu, F. Perspective: Fabrication of integrated organ-on-a-chip via bioprinting. Biomicrofluidics. 11 (3), 031301 (2017).
- Mohammed, M. I., et al. Fabrication of microfluidic devices: improvement of surface quality of CO2 laser machined poly (methylmethacrylate) polymer. Journal of Micromechanics and Microengineering. 27 (1), 015021 (2017).
- Tsao, C. W. Polymer microfluidics: Simple, low-cost fabrication process bridging academic lab research to commercialized production. Micromachines. 7 (12), 225-236 (2016).
- Kirschbaum, S. E., Baeumner, A. J. A review of electrochemiluminescence (ECL) in and for microfluidic analytical devices. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (14), 3911-3926 (2015).
- Stefanadis, C., et al. Pressure-diameter relation of the human aorta. A new method of determination by the application of a special ultrasonic dimension catheter. Circulation. 92 (8), 2210-2219 (1995).
- Williams, B. Mechanical influences on vascular smooth muscle cell function. Journal of Hypertension. 16 (12), 1921-1929 (1998).
- Abudupataer, M., et al. Aorta smooth muscle-on-a-chip reveals impaired mitochondrial dynamics as a therapeutic target for aortic aneurysm in bicuspid aortic valve disease. eLife. 10, 69310 (2021).
- Poussin, C., et al. 3d human microvessel-on-a-chip model for studying monocyte-to-endothelium adhesion under flow – application in systems toxicology. Altex. 1, 47-63 (2020).
- Yasotharan, S., Pinto, S., Sled, J. G., Bolz, S., Gunther, A. Artery-on-a-chip platform for automated, multimodal assessment of cerebral blood vessel structure and function. Lab on a Chip. 15, 2660-2669 (2015).
