Стандартизированный преаналитический протокол жидкой биопсии для последующих применений ДНК без циркуляции
Summary
Жидкая биопсия произвела революцию в нашем подходе к трансляционным исследованиям онкологии, при этом сбор, качество и хранение образцов являются важнейшими шагами для ее успешного клинического применения. Здесь мы описываем стандартизированный и проверенный протокол для последующих приложений ДНК без циркуляции, который может быть применен в большинстве трансляционных исследовательских лабораторий.
Abstract
Термин жидкая биопсия (LB) относится к молекулам, таким как белки, ДНК, РНК, клетки или внеклеточные везикулы в крови и других жидкостях организма, которые происходят из первичной и / или метастатической опухоли. LB стал опорой в трансляционных исследованиях и начал становиться частью клинической онкологической практики, обеспечивая минимально инвазивную альтернативу твердой биопсии. LB позволяет контролировать опухоль в режиме реального времени с помощью минимально инвазивной экстракции образца, такого как кровь. Приложения включают раннее выявление рака, наблюдение за пациентами для выявления прогрессирования заболевания, оценку минимального остаточного заболевания и потенциальную идентификацию молекулярной прогрессии и механизма резистентности. Для того чтобы добиться достоверного анализа этих образцов, о которых можно сообщить в клинику, преаналитические процедуры следует тщательно обдумывать и строго соблюдать. Сбор, качество и хранение образцов являются важнейшими шагами, определяющими их полезность в последующих приложениях. Здесь мы представляем стандартизированные протоколы из нашего рабочего модуля жидкой биопсии для сбора, обработки и хранения образцов плазмы и сыворотки для последующего анализа жидкой биопсии на основе свободной от циркуляции ДНК. Представленные здесь протоколы требуют стандартного оборудования и достаточно гибки для применения в большинстве лабораторий, ориентированных на биологические процедуры.
Introduction
Термин «жидкая биопсия» был определен в 2010году1 как присутствие молекул (например, белка, дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), рибонуклеиновой кислоты (РНК)), клеток или внеклеточных везикул (например, экзосом) в крови и других жидкостях организма, которые происходят из первичной опухоли. Использование образцов жидкой биопсии произвело революцию в трансляционных онкологических исследованиях, поскольку биопсия тканей, ограниченная определенной областью в определенный момент, может пропустить соответствующие клоны из-за гетерогенности опухоли. Кроме того, жидкая биопсия играет важную роль в типах опухолей, где первичная ткань скудна или недоступна, поскольку она может избежать инвазивной биопсии, снижая затраты и риск для пациентов. Кроме того, молекулярные характеристики опухоли постоянно развиваются в основном из-за терапевтического давления, и образцы жидкой биопсии могут захватывать клональную динамику опухоли, поскольку их можно брать продольно, в различные клинические и терапевтические периоды заболевания, такие как исходный уровень, лечение, наилучший ответ и прогрессирование заболевания или даже раньше. Концепция «жидкой биопсии в реальном времени» означает, что динамические изменения в опухоли могут контролироваться в режиме реального времени, что позволяет проводить прецизионную медицину при этом заболевании. Жидкая биопсия имеет множество потенциальных применений в клинике, включая скрининг и раннее выявление рака, мониторинг заболевания в режиме реального времени, выявление минимального остаточного заболевания, изучение механизмов резистентности к лечению и стратификацию пациентов на терапевтическом уровне1. Раннее выявление рецидива и прогрессирования заболевания является неудовлетворенной клинической потребностью во многих типах опухолей и является ключевым фактором повышения выживаемости и качества жизни больных раком. Обычные методы визуализации и растворимые опухолевые маркеры могут не иметь чувствительности и / или специфичности, необходимых для этой задачи. Таким образом, в клинике срочно необходимы новые прогностические маркеры, такие как те, которые основаны на циркулирующих свободных нуклеиновых кислотах.
Типы образцов, которые используются для исследований жидкой биопсии, включают, но не ограничиваются ими, образцы крови, мочи, слюны и стула. Другими опухолеспецифическими образцами могут быть клеточные аспираты, спинномозговая жидкость, плевральная жидкость, киста и асцит жидкости, мокрота и панкреатический сок2. Первые жидкости могут содержать различные типы материалов, полученных из рака, циркулирующие опухолевые клетки (CTC) или фрагменты, такие как экзосомы и бесклеточная циркулирующая опухолевая ДНК (ctDNA). Нуклеиновые кислоты могут быть инкапсулированы во внеклеточные везикулы (EV) или высвобождаться в жидкости организма из-за гибели и повреждения клеток. Циркулирующая свободная ДНК (cfDNA) в основном высвобождается в кровоток из апоптотических или некротических клеток и присутствует у всех людей, показывая повышенные уровни при воспалительных или онкологических заболеваниях3. Экзосомы представляют собой небольшие внеклеточные везикулы (~30-150 нм), секретируемые клетками, содержащими нуклеиновые кислоты, белки и липиды. Эти везикулы являются частью межклеточной коммуникационной сети и обычно встречаются во многих типах жидкостей организма2. Нуклеиновые кислоты, заключенные внутри электромобилей, защищены от суровой среды в жидкостях организма, что обеспечивает более надежный способ изучения этих молекул в условиях жидкой биопсии.
В целом, уровни циркулирующих нуклеиновых кислот в жидких образцах биопсии очень низкие, и поэтому для обнаружения необходимы чувствительные методы, такие как цифровая ПЦР или секвенирование следующего поколения (NGS). Преаналитическое управление образцом имеет решающее значение для предотвращения лизиса клеток крови и высвобождения интактной ДНК, вызывая загрязнение cfDNA геномной ДНК. Кроме того, при извлечении образцов необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать присутствия ингибиторов ферментных методов анализа.
Здесь мы представляем стандартизированный метод сбора и хранения образцов плазмы и сыворотки, который является важным первым шагом для последующих применений на основе жидкой биопсии, включая анализ циркулирующих нуклеиновых кислот.
Protocol
Representative Results
Discussion
Жидкая биопсия имеет множество потенциальных применений в разное время во время лечения рака. Во-первых, при постановке диагноза идентифицировать молекулярные маркеры опухоли, которые бы предполагали наличие потенциального опухолевого поражения, которое может быть дополнительно ис?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Сеть биомедицинских исследований в области рака (CIBERONC) за их поддержку и следующий грант проекта: LB CIBERONC PLATFORM: платформа CIBERONC для стандартизации и продвижения жидкой биопсии. ПИ Родриго Толедо, (CIBERONC), 2019-2021.
Materials
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 10 mL serological disposable pipettes | BIOFIL | GSP010010 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 10 mL Vacutainer K2 EDTA tube | Becton Dickinson | 367525 | These tubes can be used for plasma collection |
| 15 mL polypropylene centrifuge tubes | BIOFIL | CFT411150 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 3.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant | Becton Dickinson | 368965 | Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection |
| 4 mL polypropylene cryogenic vial, round bottom, self-standing | Corning | 430662 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 4 mL Vacutainer K2 EDTA tube | Becton Dickinson | 367864 | These tubes can be used for plasma collection |
| 4200 TapeStation System | Agilent | G2991BA | Several quantification methods are available with a specific application for cfDNA |
| 5 mL serological disposable pipettes | BIOFIL | GSP010005 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 8.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant | Becton Dickinson | 366468 | Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection |
| Centrifuge, capable of ~3000 x g with a swing bucket rotor | Thermo Fisher Scientific | Sorvall ST 16 10688725 | Any standard tubes/equipment can be used |
| Freezer storage boxes for 1–4 mLcryogenic vials | Corning | 431120 | These boxes are needed when using 4 mL vials for storage |
| p1000 pipette tips | CORNING | 4809 | Any standard tubes/equipment can be used |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | Any commercially available kit that is specific for cfDNA isolation can be used with this blood prcessing protocol. |
| Streck Cell-Free DNA BCT CE tubes 10 mL | Streck | 218997 | These tubes can be used for plasma collection |
| Temperature Freezer (-80 °C) | ESCO | 2180104 | Any standard tubes/equipment can be used |
Riferimenti
- Alix-Panabières, C., Pantel, K. Clinical applications of circulating tumor cells and circulating tumor DNA as liquid biopsy. Cancer Discovery. 6 (5), 479-491 (2016).
- Zhou, B., et al. Application of exosomes as liquid biopsy in clinical diagnosis. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 144 (2020).
- Bettegowda, C., et al. Liquid biopsies: Genotyping circulating tumor DNA. Nature Medicine. 4 (6), (2014).
- Heitzer, E., et al. Recommendations for a practical implementation of circulating tumor DNA mutation testing in metastatic non-small-cell lung cancer. ESMO Open. 7 (2), 100399 (2022).
- Gennari, A., et al. ESMO Clinical Practice Guideline for the diagnosis, staging and treatment of patients with metastatic breast cancer. Annals of Oncology: Official Journal of the European Society for Medical Oncology. 32 (12), 1475-1495 (2021).
- Van Buren, T., Arwatz, G., Smits, A. J. A simple method to monitor hemolysis in real time. Scientific Reports. 10 (1), 5101 (2020).
- Ignatiadis, M., Sledge, G. W., Jeffrey, S. S. Liquid biopsy enters the clinic – implementation issues and future challenges. Nature Reviews. Clinical Oncology. 18 (5), 297-312 (2021).
- Sidstedt, M., et al. Inhibition mechanisms of hemoglobin, immunoglobulin G, and whole blood in digital and real-time PCR. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (10), 2569-2583 (2018).
- Maass, K. K., et al. From sampling to sequencing: A liquid biopsy pre-analytic workflow to maximize multi-layer genomic information from a single tube. Cancers. 13 (12), 3002 (2021).
- Greytak, S. R., et al. Harmonizing cell-free DNA collection and processing practices through evidence-based guidance. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 26 (13), 3104-3109 (2020).
- Trigg, R. M., Martinson, L. J., Parpart-Li, S., Shaw, J. A. Factors that influence quality and yield of circulating-free DNA: A systematic review of the methodology literature. Heliyon. 4 (7), 00699 (2018).
- Boissier, E., et al. The centrifuge brake impacts neither routine coagulation assays nor platelet count in platelet-poor plasma. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 58 (9), 185-188 (2020).
- Johansson, G., et al. Considerations and quality controls when analyzing cell-free tumor DNA. Biomolecular Detection and Quantification. 17, 100078 (2019).
- Casas-Arozamena, C., et al. Genomic profiling of uterine aspirates and cfDNA as an integrative liquid biopsy strategy in endometrial cancer. Journal of Clinical Medicine. 9 (2), 585 (2020).
- Alcoceba, M., et al. Liquid biopsy: a non-invasive approach for Hodgkin lymphoma genotyping. British Journal of Haematology. 195 (4), 542-551 (2021).
- Szpechcinski, A., et al. Cell-free DNA levels in plasma of patients with non-small-cell lung cancer and inflammatory lung disease. British Journal of Cancer. 113 (3), 476-483 (2015).
- Earl, J., et al. Somatic mutation profiling in the liquid biopsy and clinical analysis of hereditary and familial pancreatic cancer cases reveals kras negativity and a longer overall survival. Cancers. 13 (7), 1612 (2021).
- Lampignano, R., et al. Multicenter evaluation of circulating cell-free DNA extraction and downstream analyses for the development of standardized (pre)analytical work flows. Clinical Chemistry. 66 (1), 149-160 (2020).
- Febbo, P. G., et al. Minimum technical data elements for liquid biopsy data submitted to public databases. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 107 (4), 730-734 (2020).
- De Mattos-Arruda, L., Siravegna, G. How to use liquid biopsies to treat patients with cancer. ESMO Open. 6 (2), 100060 (2021).
