다운스트림 순환 프리 DNA 응용을 위한 표준화된 액체 생검 사전 분석 프로토콜
Summary
액체 생검은 종양학 번역 연구에 대한 우리의 접근 방식에 혁명을 일으켰으며, 샘플 수집, 품질 및 보관은 성공적인 임상 적용을위한 중요한 단계입니다. 여기에서는 대부분의 번역 연구 실험실에 적용 할 수있는 다운스트림 순환 프리 DNA 응용 프로그램에 대한 표준화되고 검증 된 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
액체 생검 (LB)이라는 용어는 단백질, DNA, RNA, 세포 또는 혈액 및 원발성 및 / 또는 전이성 종양에서 유래 한 다른 체액의 세포 밖 소포와 같은 분자를 의미합니다. LB는 번역 연구의 주류로 부상했으며 임상 종양학 실습의 일부가되기 시작하여 고형 생검에 대한 최소 침습적 대안을 제공합니다. LB는 혈액과 같은 최소 침습적 샘플 추출을 통해 종양을 실시간으로 모니터링 할 수 있습니다. 응용 분야에는 조기 암 검출, 질병 진행 검출을위한 환자 추적 관찰, 최소 잔류 질환의 평가, 분자 진행 및 내성 메커니즘의 잠재적 인 확인이 포함됩니다. 클리닉에서보고 할 수있는 이러한 샘플에 대한 신뢰할 수있는 분석을 달성하기 위해서는 사전 분석 절차를 신중하게 고려하고 엄격하게 따라야합니다. 샘플 수집, 품질 및 스토리지는 다운스트림 응용 프로그램에서의 유용성을 결정하는 중요한 단계입니다. 여기에서는 순환이 없는 DNA를 기반으로 하는 다운스트림 액체 생검 분석을 위해 혈장 및 혈청 샘플을 수집, 처리 및 저장하기 위한 액체 생검 작업 모듈의 표준화된 프로토콜을 제시합니다. 여기에 제시된 프로토콜은 표준 장비를 필요로하며 생물학적 절차에 중점을 둔 대부분의 실험실에 적용 할 수있을만큼 유연합니다.
Introduction
용어 “액체 생검”은 2010년1 차 종양으로부터 기원되는 혈액 및 다른 체액에서 분자(예를 들어, 단백질, 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA)), 세포밖 소포(예를 들어, 엑소좀)의 존재로서 정의되었다. 액체 생검 샘플의 사용은 특정 순간에 특정 영역으로 제한된 조직 생검이 종양 이질성으로 인해 관련 클론을 놓칠 수 있기 때문에 번역 종양학 연구에 혁명을 일으켰습니다. 또한, 액체 생검은 침습적 생검을 피할 수 있기 때문에 원발성 조직이 부족하거나 접근할 수 없는 종양 유형에서 관련 역할을 하며, 이는 환자의 비용과 위험을 감소시킬 수 있기 때문이다. 더욱이, 종양 분자 특성은 주로 치료 압력으로 인해 끊임없이 진화하고 있으며, 액체 생검 샘플은 기준선, 치료, 최상의 반응, 질병 진행 또는 심지어 전과 같은 질병의 다른 임상 및 치료 시간에서 종적으로, 복용 할 수 있기 때문에 종양 클론 역학을 포착 할 수 있습니다. “실시간 액체 생검”의 개념은 종양의 동적 변화를 실시간으로 모니터링 할 수 있으므로이 질병에서 정밀 의학을 가능하게한다는 것을 의미합니다. 액체 생검은 암의 스크리닝 및 조기 발견, 질병의 실시간 모니터링, 최소 잔류 질환의 검출, 치료 저항성에 대한 메커니즘 연구 및 치료 수준1에서 환자의 계층화를 포함하여 클리닉에서 수많은 잠재적 인 응용 프로그램을 가지고 있습니다. 질병 재발 및 진행의 조기 발견은 많은 종양 유형에서 충족되지 않은 임상 적 요구이며 암 환자의 생존과 삶의 질을 높이는 핵심 요소입니다. 일상적인 영상화 방식 및 가용성 종양 마커는 이 작업에 필요한 민감도 및/또는 특이성이 부족할 수 있다. 따라서, 신규한 예측 마커는 순환하는 유리 핵산에 기초한 것들과 같은 클리닉에서 긴급하게 필요하다.
액체 생검 연구에 사용되는 샘플의 유형은 혈액, 소변, 타액 및 대변 샘플을 포함하지만 이에 국한되지 않습니다. 다른 종양-특이적 샘플은 세포 아스피레이트, 뇌척수액, 흉막액, 낭종 및 복수액, 객담, 및 췌장 주스2일 수 있다. 전액은 상이한 유형의 암 유래 물질, 순환 종양 세포 (CTC), 또는 엑소좀 및 무세포 순환 종양 DNA (ctDNA)와 같은 단편을 함유할 수 있다. 핵산은 세포밖 소포(EVs)에 캡슐화되거나 세포 사멸 및 손상으로 인해 체액으로 방출될 수 있다. 순환 자유 DNA (cfDNA)는 주로 사멸 또는 괴사 세포로부터 혈류로 방출되며 모든 개체에 존재하며 염증성 또는 종양학 질환에서 증가 된 수준을 보여줍니다3. 엑소좀은 핵산, 단백질 및 지질을 포함하는 세포에 의해 분비되는 작은 세포밖 소포 (∼30-150 nm)이다. 이 소포는 세포 간 통신 네트워크의 일부를 형성하며 일반적으로 많은 유형의 체액에서 발견됩니다2. EV 내부에 둘러싸인 핵산은 체액 내의 가혹한 환경으로부터 보호되므로 액체 생검 설정에서 이러한 분자를 연구하는보다 강력한 방법을 제공합니다.
전반적으로, 액체 생검 샘플에서 순환 핵산의 수준은 매우 낮기 때문에 디지털 PCR 또는 차세대 시퀀싱 (NGS)과 같은 검출에 민감한 방법이 필요합니다. 샘플의 사전 분석 관리는 혈액 세포 용해 및 손상되지 않은 DNA의 방출을 방지하여 cfDNA와 게놈 DNA의 오염을 일으키는 데 중요합니다. 또한, 효소 기반 분석 방법의 억제제의 존재를 피하기 위해 샘플을 추출 할 때주의해야합니다.
여기서 우리는 혈장 및 혈청 샘플의 수집 및 저장을위한 표준화 된 방법을 제시하며, 이는 순환 핵산 분석을 포함한 액체 생검 기반 하류 적용을위한 중요한 첫 번째 단계입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
액체 생검은 암 관리 중 다른 시간에 수많은 잠재적 인 응용 프로그램을 가지고 있습니다. 첫째, 진단에서 임상적으로 더 조사될 수 있는 잠재적인 종양 병변의 존재를 시사하는 종양 분자 마커를 동정한다. 둘째, 질병의 실시간 모니터링을 위한 치료 동안, 치료 분자 반응의 평가, 클론 진화, 및 질병 재발 또는 치료 저항성의 조기 검출. 마지막으로, 외과 적 치료 후, 최소한의 잔류 질환의 검출을?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 그들의 지원과 다음과 같은 프로젝트 보조금에 대한 암 생물 의학 연구 네트워크 (CIBERONC)에 감사드립니다 : LB CIBERONC PLATFORM : CIBERONC 플랫폼 액체 생검의 표준화 및 홍보. PI 로드리고 톨레도, (CIBERONC), 2019-2021.
Materials
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 10 mL serological disposable pipettes | BIOFIL | GSP010010 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 10 mL Vacutainer K2 EDTA tube | Becton Dickinson | 367525 | These tubes can be used for plasma collection |
| 15 mL polypropylene centrifuge tubes | BIOFIL | CFT411150 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 3.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant | Becton Dickinson | 368965 | Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection |
| 4 mL polypropylene cryogenic vial, round bottom, self-standing | Corning | 430662 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 4 mL Vacutainer K2 EDTA tube | Becton Dickinson | 367864 | These tubes can be used for plasma collection |
| 4200 TapeStation System | Agilent | G2991BA | Several quantification methods are available with a specific application for cfDNA |
| 5 mL serological disposable pipettes | BIOFIL | GSP010005 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 8.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant | Becton Dickinson | 366468 | Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection |
| Centrifuge, capable of ~3000 x g with a swing bucket rotor | Thermo Fisher Scientific | Sorvall ST 16 10688725 | Any standard tubes/equipment can be used |
| Freezer storage boxes for 1–4 mLcryogenic vials | Corning | 431120 | These boxes are needed when using 4 mL vials for storage |
| p1000 pipette tips | CORNING | 4809 | Any standard tubes/equipment can be used |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | Any commercially available kit that is specific for cfDNA isolation can be used with this blood prcessing protocol. |
| Streck Cell-Free DNA BCT CE tubes 10 mL | Streck | 218997 | These tubes can be used for plasma collection |
| Temperature Freezer (-80 °C) | ESCO | 2180104 | Any standard tubes/equipment can be used |
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