Ett standardiserat preanalytiskt protokoll för flytande biopsi för nedströms cirkulationsfria DNA-applikationer

Summary

Den flytande biopsin har revolutionerat vårt tillvägagångssätt för onkologiska translationella studier, med provinsamling, kvalitet och lagring som avgörande steg för dess framgångsrika kliniska tillämpning. Här beskriver vi ett standardiserat och validerat protokoll för nedströms cirkulationsfria DNA-applikationer som kan tillämpas i de flesta translationella forskningslaboratorier.

Abstract

Termen flytande biopsi (LB) avser molekyler som proteiner, DNA, RNA, celler eller extracellulära vesiklar i blod och andra kroppsvätskor som härrör från den primära och / eller metastatiska tumören. LB har framstått som en grundpelare i translationell forskning och har börjat bli en del av klinisk onkologipraxis, vilket ger ett minimalt invasivt alternativ till fast biopsi. LB möjliggör realtidsövervakning av en tumör via en minimalt invasiv provutvinning, såsom blod. Applikationerna inkluderar tidig upptäckt av cancer, patientuppföljning för upptäckt av sjukdomsprogression, bedömning av minimal restsjukdom och potentiell identifiering av molekylär progression och resistensmekanism. För att uppnå en tillförlitlig analys av dessa prover som kan rapporteras i kliniken bör de preanalytiska procedurerna noggrant övervägas och följas strikt. Provinsamling, kvalitet och lagring är viktiga steg som avgör deras användbarhet i underordnade program. Här presenterar vi standardiserade protokoll från vår flytande biopsiarbetsmodul för insamling, bearbetning och lagring av plasma- och serumprover för nedströms flytande biopsianalys baserat på cirkulerande fritt DNA. Protokollen som presenteras här kräver standardutrustning och är tillräckligt flexibla för att kunna tillämpas i de flesta laboratorier som fokuserar på biologiska förfaranden.

Introduction

Termen “flytande biopsi” definierades 2010¹ som närvaron av molekyler (t.ex. protein, deoxiribonukleinsyra (DNA), ribonukleinsyra (RNA)), celler eller extracellulära vesiklar (t.exosomer) i blod och andra kroppsvätskor som härrör från den primära tumören. Användningen av flytande biopsiprover har revolutionerat translationell onkologiforskning eftersom vävnadsbiopsier, begränsade till en viss region vid ett visst ögonblick, kan missa relevanta kloner på grund av tumörheterogenitet. Dessutom spelar flytande biopsi en relevant roll i tumörtyper där primär vävnad är knapp eller inte tillgänglig, eftersom det kan undvika en invasiv biopsi, vilket minskar kostnaderna och risken för patienterna. Dessutom utvecklas tumörmolekylära egenskaper ständigt främst på grund av terapitrycket, och flytande biopsiprover kan fånga tumörklonaldynamiken eftersom de kan tas i längdriktningen, i olika kliniska och terapeutiska tider av sjukdomen, såsom baslinje, vid behandling, bästa svar och vid sjukdomsprogression eller till och med tidigare. Begreppet “flytande biopsi i realtid” innebär att dynamiska förändringar i tumören kan övervakas i realtid, vilket möjliggör precisionsmedicin vid denna sjukdom. Den flytande biopsin har många potentiella tillämpningar i kliniken, inklusive screening och tidig upptäckt av cancer, realtidsövervakning av sjukdom, upptäckt av minimal restsjukdom, studier av mekanismer för behandlingsresistens och stratifiering av patienter på terapeutisk nivå¹. Tidig upptäckt av återkommande och progression av sjukdomar är ett ouppfyllt kliniskt behov i många tumörtyper och är en nyckelfaktor för att öka överlevnaden och livskvaliteten för cancerpatienter. Rutinmässiga avbildningsmetoder och lösliga tumörmarkörer kan sakna den känslighet och / eller specificitet som krävs för denna uppgift. Således behövs nya prediktiva markörer i kliniken, såsom de som är baserade på cirkulerande fria nukleinsyror.

De typer av prover som används för flytande biopsistudier inkluderar men är inte begränsade till blod-, urin-, saliv- och avföringsprover. Andra tumörspecifika prover kan vara cellsaspirater, cerebrospinalvätska, pleuravätska, cyst- och ascitesvätska, sputum och bukspottkörteljuice². De tidigare vätskorna kan innehålla olika typer av cancer-härledda material, cirkulerande tumörceller (CTC) eller fragment såsom exosomer och cellfritt cirkulerande tumör-DNA (ctDNA). Nukleinsyror kan vara inkapslade i extracellulära vesiklar (EV) eller släppas ut i kroppsvätskor på grund av celldöd och skada. Cirkulerande fritt DNA (CFDNA) frigörs huvudsakligen i blodomloppet från apoptotiska eller nekrotiska celler och finns hos alla individer, vilket visar ökade nivåer vid inflammatoriska eller onkologiska sjukdomar³. Exosomer är små extracellulära vesiklar (~ 30-150 nm) utsöndras av celler som innehåller nukleinsyror, proteiner och lipider. Dessa vesiklar utgör en del av det intercellulära kommunikationsnätverket och finns vanligtvis i många typer av kroppsvätskor². Nukleinsyrorna som är inneslutna i elbilar är skyddade från den hårda miljön i kroppsvätskor, vilket ger ett mer robust sätt att studera dessa molekyler i flytande biopsiinställning.

Sammantaget är nivåerna av cirkulerande nukleinsyror i flytande biopsiprover mycket låga, och därför behövs känsliga metoder för detektion, såsom digital PCR eller nästa generations sekvensering (NGS). Preanalytisk hantering av provet är avgörande för att förhindra blodcellslys och frisättning av intakt DNA, vilket orsakar kontaminering av CFDNA med det genomiska DNA. Dessutom måste man vara försiktig vid extraktion av prover för att undvika förekomst av hämmare av enzymbaserade analysmetoder.

Här presenterar vi en standardiserad metod för insamling och lagring av plasma- och serumprover, vilket är ett avgörande första steg för flytande biopsibaserade nedströmsapplikationer, inklusive cirkulerande nukleinsyraanalyser.

Protocol

Tidigare etiskt godkännande erhölls från deltagande centra före utvinning av blodprover. Följande protokoll för serum- och plasmaisolering utfördes i enlighet med de etiska principerna för biomedicinsk forskning. OBS: Tidigare överväganden innan protokollet påbörjas finns här. Förhandsetiskt godkännande krävs för användning av humanprover i biomedicinsk forskning, med motsvarande informerade samtycke. Ett klass II biosäkerhetsskåp krävs för att hantera blodprover. En labb…

Representative Results

Efter centrifugering av blodrören utan antikoagulant uppträder den övre fasen en blekgul och motsvarar serumfraktionen (figur 2). Denna fraktion avlägsnas försiktigt och alikvoteras för efterföljande analys. Hemolys kan vara närvarande i antingen plasma- eller serumfraktionen, och den övre fasen kommer att ha ett rödaktigt utseende, vilket indikerar närvaron och graden av hemolys (Figur 3). Efter…

Discussion

Den flytande biopsin har många potentiella tillämpningar vid olika tidpunkter under hanteringen av cancer. Först vid diagnos för att identifiera tumörmolekylära markörer som skulle föreslå förekomsten av en potentiell tumörskada som kan undersökas ytterligare kliniskt. För det andra, under behandling för realtidsövervakning av sjukdomen, bedömning av behandlingsmolekylärt svar, klonal evolution och tidig upptäckt av sjukdomsåterfall eller behandlingsresistens. Slutligen, efter den kirurgiska behandling…

Materials

1.5 mL Eppendorf tubes	Eppendorf	0030 120.086	Any standard tubes/equipment can be used
10 mL serological disposable pipettes	BIOFIL	GSP010010	Any standard tubes/equipment can be used
10 mL Vacutainer K2 EDTA tube	Becton Dickinson	367525	These tubes can be used for plasma collection
15 mL polypropylene centrifuge tubes	BIOFIL	CFT411150	Any standard tubes/equipment can be used
3.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant	Becton Dickinson	368965	Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection
4 mL polypropylene cryogenic vial, round bottom, self-standing	Corning	430662	Any standard tubes/equipment can be used
4 mL Vacutainer K2 EDTA tube	Becton Dickinson	367864	These tubes can be used for plasma collection
4200 TapeStation System	Agilent	G2991BA	Several quantification methods are available with a  specific application for cfDNA
5 mL serological disposable pipettes	BIOFIL	GSP010005	Any standard tubes/equipment can be used
8.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant	Becton Dickinson	366468	Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection
Centrifuge, capable of ~3000 x g with a swing bucket rotor	Thermo Fisher Scientific	Sorvall ST 16  10688725	Any standard tubes/equipment can be used
Freezer storage boxes for 1–4 mLcryogenic vials	Corning	431120	These boxes are needed when using 4 mL vials for storage
p1000 pipette tips	CORNING	4809	Any standard tubes/equipment can be used
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit	Qiagen	55114	Any commercially available kit that is specific for cfDNA isolation can be used with this blood prcessing protocol.
Streck Cell-Free DNA BCT CE tubes 10 mL	Streck	218997	These tubes can be used for plasma collection
Temperature Freezer (-80 °C)	ESCO	2180104	Any standard tubes/equipment can be used